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    发布时间: 2018 - 12 - 10
    英文标题:Selection and Validation of Novel RT-qPCR Reference Genes under Hormonal Stimuli and in Diferent Tissues of Santalum album杂志:Scientific  Reports影响因子:IF=4.122摘要   逆转录实时定量聚合酶链式反应 (RT-qPCR)因其高通量、特异性和敏感性而被广泛应用于基因表达水平的研究。为了获得准确可靠的结果,RT-qPCR分析必须有一个合适的参考基因。到目前为止,经济热带树种檀香((Santalum album L.)还没有被验证的可靠参考基因。在本研究中,有13个候选参考基因(包括从大量的檀香转录组数据中筛选出的12个新的可能的参考基因,以及目前使用的β-actin基因)在不同的组织(茎、叶、根和愈伤组织)、以及水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯 (MeJA)、赤霉素(GA)处理作用下的愈伤组织中,用GeNorm,NormFinder,BestKeeper,Delta CT和 RefFinder算法综合验证。几种新的候选参考基因比目前使用的传统基因ACT要稳定得多。SA处理中ODD和Fbp1、MeJA处理中的CSA 和Fbp3、JA处理中的PP2C和Fbp2、以及3个激素处理中FBP 1和FBP 2,分别是最准确的参考基因。当FAB1A与PP2C结合后,被鉴定为四种组织最适宜的参考基因组合。而HLMt, PPR和FAB1A的组合则是所有实验样本中最理想的参考基因。此外,为了验证我们的结果,我们还通过参考基因及他们的组合在MeJA处理下的三种檀香组织中评估了SaSSy基因的相对表达水平。本研究中所鉴定的参考基因将提高RT-qPCR分析的准确性,并将有...
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    发布时间: 2018 - 12 - 03
    发表期刊:Microbiome影响因子:9.133(SCI一区)研究背景最近几年,对肠道微生物群(GM)的研究已经不仅仅是描述分类组成,通常是将16S rRNA基因测序应用于粪便样本,更广泛地研究GM的功能潜力,这是通过鸟枪法宏基因组学(MG)方法实现的。群体MG研究表明,尽管存在较大的个体间结构/组成变异,GMs仍有一组稳定的核心功能。然而,由于测序的基因不一定表达,MG不能提供可靠的信息,说明哪些微生物的功能特征实际上在响应宿主代谢、免疫、神经生物学、饮食或其他环境因素的刺激而发生变化。相反,这类信息可以由功能宏组学收集,如宏转录组学(MT)和宏蛋白质组学(MP),它们对微扰具有较高的敏感性,因此可能更好地反映宿主微生物相互作用。在这方面,特别令人感兴趣的是调查人类群体中潜在的和实际活跃的GM特征之间的关系,为了从已知的MG的潜能开始鉴定在健康肠中组成型表达的微生物功能。最近的一项研究已经针对MT实现了这一目标,在具有最高表达率(mRNA/DNA比率)和参与淀粉代谢,氨基酸生物合成,孢子形成和以及具有最低表达率的肽聚糖生物合成的基因中发现了核糖体蛋白和柠檬酸循环酶的转录物。人们对微生物蛋白的了解较少,尽管它们提供了有关GM代谢的主要信息,并且代表了宿主-GM相互作用中的关键分子。尽管有一些开创性的研究提出了对疾病有关的人类群体中的宏基因组和宏蛋白组的分析,到目前为止,还没有系统地、比较地调查健康人群的分类学和功能特征,这种特征可能和实际由GM表达。材料与方法01实验设计图1本研究的实验设计注:从临床监测的撒丁岛人群中选出15名健康成人(男性7名,女性8名)。从每个人身上采集粪便样本,同时进行Illumina鸟枪法DNA测序(宏基因组)和LTQ-Orbitrap鸟枪法质谱分析(宏蛋白组)。宏基因组学也被用作序列数据库,以便进行严格的宏蛋白质组/宏基因组比较,并进行分类和功...
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    发布时间: 2018 - 11 - 26
    摘要全转录组范围内鉴定能与蛋白结合的RNA(RBPs),是了解转录后基因调控网络的必要条件。然而RBPs蛋白组的研究主要局限于多聚腺苷酸的RNA与蛋白的结合,对于没有ploy-A尾的RNA(主要的是非编码RNA和RNA前体)几乎都没发现。本文介绍了一种点击化学(主旨是通过小单元的拼接,来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。它尤其强调开辟以碳-杂原子键(C-X-C)合成为基础的组合化学新方法,并借助这些反应(点击反应)来简单高效地获得分子多样性。)辅助的RNA互作捕获策略(CARIC),能够对RBPs进行无差别鉴定,不受RNA是否具有ploy-A尾的约束。CARIC主要是利用炔基尿苷类似物对RNA进行标记,并在活体内进行RNA-protein光照交联,然后与叠氮化物生物素进行点击化学反应,亲和富集后进行蛋白组分析。利用CARIC在人的宫颈癌细胞中鉴定到597个RBPs,包括130个之前未知的RBPs。这些新发现的RBPs可能是和非编码RNA结合的,因此发现了一些之前未知的非编码RNA参与的过程(例如蛋白酶体功能和中间代谢)。材料方法实验材料:人的宫颈癌细胞,胚肾细胞;质粒构建和细胞转染:克隆宫颈癌细胞cDNA(hnRNPC,MBNL1,VDAC1,NME2),克隆质粒:VigoFect;几种已知RPBs用来验证CARIC技术成功率CARIC分离出的RNA测序:Illumina HisEq 4000 PE150;蛋白质谱检测:LC-MS/MS,Easy nLC 1000 system +Velos Pro Orbitrap Elite mass spectrometer;质谱数据分析:MaxQuant version 1.5.5.1(原始数据分析),依靠人的蛋白数据(UniProt)Andromeda search engine进行蛋白查询;CARIC RBPs验证:CLIP...
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    发布时间: 2018 - 11 - 09
    前沿慢性阻塞性肺病(COPD)是一种炎性疾病,其特征在于进行性空气流量限制,并且被认为部分地由于响应于慢性空气污染物暴露(主要来自吸烟)而引起的夸大的肺部炎症。目前可用的治疗方法在很大程度上是无效的。因此,有效治疗COPD迫切需要新型的治疗药物。前期系统药理学鉴定了补肺益肾方(BYF)的195种潜在靶点,并被证实对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠有短期治疗作用。然而,对慢性阻塞性肺疾病(COPD)的长期疗效及机制尚不清楚。因此,本研究以慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠为研究对象,于第9~20周给药。然后通过转录组学-蛋白质组学-代谢组学分析第32周BYF对慢性阻塞性肺病大鼠的长期影响。材料与方法样本收集第0-8周构建COPD大鼠模型,将32只大鼠置于一个暴露于烟草和反复肺炎克雷伯菌感染的封闭的盒子里,第9-20周大鼠每日灌胃给予生理盐水(2mL)、BYF(4.44g/kg,0.5g/ml)和氨茶碱(2.3mg/kg)。检测方法转录组:Microarray(4×44K)大鼠全基因组表达谱芯片;蛋白组:8-plex iTRAQ,NanoLC-QTOF-MS;代谢组:Agilent-1200 LC-Agilent-6520 Q-TOF;数据分析Agilent GeneSpring GX software version 11.0Mascot:蛋白质鉴定Mass Hunter:代谢物鉴定SIMCA-P:PLS-DA基因、蛋白质和代谢物集富集、网络和通路分析Bingo(CytosCapev3.1.1插件)用于分析转录本和蛋白质的分子功能;DAVID和KEGG数据库对转录本和蛋白质进行途径富集分析。Metscape用于分析基因、蛋白质和代谢组学数据的整合途径;ClueGO(Cytoscape插件被用来探索基因和蛋白的分子功能。MetaboAnalyst 3.0被用来确定代谢物...
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    发布时间: 2018 - 11 - 08
    砷暴露对小鼠肠道宏基因组和代谢谱的响应IF=8.3091.摘要背景:人类肠道是一个极其复杂、多样和庞大的微生物群落-肠道微生物群。肠道微生物群在代谢过程、能量产生、免疫和认知发育、上皮稳态等方面发挥着重要作用。然而,肠道微生物群的组成和多样性很容易受到外界因素的影响,这就增加了接触有毒环境化学物质导致肠道微生物群改变或失调的可能性。砷的暴露影响全世界的大量人口,并且与许多疾病有关,包括癌症,糖尿病和心血管疾病。目的:研究了砷暴露对肠道微生物组成及其代谢状况的影响。方法:采用16S rRNA基因测序和质谱代谢组学分析相结合的方法,研究砷暴露对肠道微生物群的功能影响。结果:16S rRNA基因测序结果表明,10 ppm砷暴露4周后,砷对C57BL/6小鼠肠道微生物组分有明显的干扰作用。此外,代谢组学图谱显示了一种并行效应,许多肠道菌群相关的代谢物在多个生物基质中被干扰。结论:砷的暴露不仅改变肠道微生物群落的丰度水平,而且在功能水平上也严重干扰其代谢状况。这些发现可能为肠道微生物群的微扰及其作为接触砷导致或加重人类疾病的潜在新机制的作用提供新的见解。2.材料和方法动物和处理:无特定病原体的C57BL/6雌性小鼠20只(6周龄,体重20±3g)。平均分为两组。两组小鼠在同样的环境条件下饲养,供给相同的食物和水。饲养到8周龄后,处理组:饮用水中注入无机砷(亚砷酸钠,10ppm)持续四周;对照组:依旧供给清水。在整个实验过程中,每天评估小鼠腹泻,脱水和身体状况恶化的情况。用砷4周后,用二氧化碳对小鼠实施安乐死并进行尸体剖检。对肝脏(左侧,内侧,右侧和尾状叶)和结肠(远端,横向和前期结肠)的多发区域的炎症,水肿,上皮缺损,高血浆和发育异常等指标进行评估。病理评分未显示对照组和砷治疗组小鼠之间存在任何显着差异,也未观察到体重,死亡率和食物摄入量的任何显着变化。16SrRNA测序数...
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    发布时间: 2018 - 10 - 30
    文章题目:A strategy for association study on intestinal microbiomeand brain metabolome across lifespan of rats.杂志:Analytical  Chemistry 影响因子:IF=6.0421摘要   人们越来越认识到微生物群-肠-脑轴在哺乳动物一生中对哺乳动物生长和健康的不同作用。大量研究表明,肠道微生物群及其代谢物广泛参与脑与肠的沟通。脑代谢组与肠道微生物的关联研究是一个活跃的领域,它提供了大量关于微生物、脑和肠道相互作用的信息,但数据大小和复杂的层次关系是形成重要的、可重复的结论的主要障碍。本研究采用多种分析平台和生物信息学方法,对雄性Wistar大鼠在生长过程中的脑代谢和肠道微生物群关联分析进行了两级策略的研究。轨迹分析表明,与年龄相关的脑代谢组和肠道微生物在总体变化模式上具有相似性。 四个高水平分类的相关对“代谢类型—细菌门”包含“脂质-螺旋菌”、“游离脂肪酸-厚壁菌门”、“胆汁酸-厚壁菌门”、“神经递质-拟杆菌门”在单元-多元相关分析和功能分析的基础上被筛选出。进一步鉴定了上述高水平关键对中的四组特异性“代谢产物-细菌”关联对。通过一项独立的动物研究验证了关键相关对的有效性。这种两级策略有效地识别了从系统多组学研究中获得的大数据集中的主要相关性,加深我们对大脑和肠道之间终生联系的理解。材料与方法动物材料:正常生长实验取出生后第1、3、7、12、24、56、111周的雄性大鼠全脑和肠内容物,每组6只,共42只。      在限制饮食验证实验中,12只雄性大鼠(4周龄)被喂食3周,然后6只(随机选择)饲喂Libitum,其余6只饲喂60%的Libitum 5周...
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发布时间: 2017 - 02 - 17
摘要:DNA N6-甲基脱氧腺苷(6mA)主要是原核(细菌)DNA修饰,(以往的研究表明5mC修饰在调控哺乳动物基因表达中起着非常重要的作用;而6mA修饰广泛存在于细菌中,在DNA复制、修复、基因表达调控及宿主-病原体相互拮抗等方面发挥重要的功能。6mA修饰方式在高等真核生物基因组中由于其含量极低,因此其研究一直被忽视。)目前已经发现其在真核DNA中存在并发挥表观遗传的作用。本文研究表明,在脊椎动物的早期胚胎发育期间,6mA累积到总脱氧腺苷的0.1-0.2%,但随着胚胎发育,逐渐减少。在此过程中,大部分的6mAs位于基因组的重复区域。 方法:收集斑马鱼早期胚胎、分离gDNA。将未受精的精子从麻醉的雄性中挤出,将卵母细胞从麻醉的雌性中挤出。受精胚在28.5℃的Holtfreter's溶液中生长,并根据标准形态学标准分期。将卵母细胞和不同阶段的胚胎在液氮中冷冻,直到收集到足够的胚胎用于DNA提取。 猪卵母细胞采集和体外成熟。在屠宰场收集青春期前母猪的卵巢。用注射器吸出3-6mm的窦卵泡,收集卵丘-卵母细胞复合体(COCs)。用PVA-TL-HEPES培养基洗涤三次,再用TCM-199培养基洗涤两次。随后,在5%CO2的潮湿气氛中,在38.5℃下不含激素的TCM-199培养基中使COCs成熟42- 44小时。然后,在工作溶液(0.03g透明质酸酶,5.46g甘露醇,0.001g BSA,5ml PVA-TL-HEPES和95ml ddH2O)中洗涤COC以除去卵丘细胞,并取出成熟卵母细胞,-80℃冻存。体外受精。体外成熟后,用2ml新鲜IVF培养基轻轻洗涤COC以除去卵丘细胞。洗涤后,将裸露的卵母细胞置于50μL矿物油覆盖的IVF培养基中。将卵母细胞在38.5℃,5%CO2下孵育30分钟,直到加入精子。将卵母细胞与精子在IVF培养基中在38.5℃,5%CO2下...
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发布时间: 2016 - 12 - 22
摘要:炎症性肠病(IBD)可能是基因与环境相互作用产生的。本文研究了240个初诊病例IBD和190个对照的全基因组表观遗传范围内的DNA甲基化差异。通过全基因组重亚硫酸盐测序,鉴定到439个差异甲基化位点(DMP)和5个差异甲基化区域(DMR)。结合基因组数据和表观遗传数据,找出甲基化的数量性状位点。与VMP1甲基化相关的两个SNP位点,与已知的IBD的SNP位点连锁不平衡。TXK基因(DMR内的)与IBD相关的高甲基化,与全血和CD8+ T细胞的基因表达呈负相关,和其他的细胞不是这种关系。因此,IBD中位点特异性的DNA甲基化的变化,会引起潜在的基因型和细胞特异性的基因表达量的改变。备注:先前的GWAS研究已经证明了200个SNP位点与IBD相关。 材料与方法:样品收集和细胞分离。在以下管中采集血液样品:9ml Z血清凝块激活空泡(Greiner,Frickenhausen,Germany),9ml K3 EDTA空泡(Greiner)和PAXgene血液RNA管(BD,NJ,USA)。将18-36ml的EDTA缓冲血液用于初始Ficoll(Ficoll-Paque,GE healthcare,Bucks,UK)密度梯度离心以获得外周血单核细胞。使用autoMACs Pro细胞分离器(Miltenyi,Germany)对用抗体包被的微珠(人CD14 +,CD8 +和CD4 +微珠,20ml / 1×107个细胞)标记的细胞进行免疫磁性分离。在初始CD14 +耗尽步骤后进行CD4 +分离。使用荧光抗体染色和流式细胞仪(FACS Aria II,BD,Germany)估计细胞纯度。在外周血单核细胞消耗后,将红细胞在冰上裂解(1,000ml dH2O,8.3g NH4Cl,1.0g KHO3和1.8ml 5%EDTA),通过离心回收白细胞。...
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发布时间: 2016 - 10 - 14
摘要:缺氧是水环境中最广泛和最紧迫的问题之一。本文的研究表明,海洋青鳉鱼(Oryzias melastigma)缺氧后,导致F1和F2代的生殖障碍(性腺发育延缓、精子密度减少、精子活力降低),尽管这些后代(和他们的生殖细胞)从未暴露于缺氧环境。进一步研究表明,跨代的生殖障碍与F0、F2的精子特异基因的差异甲基化模式有关,相关的转录组和蛋白质组的改变可能影响精子的发生。所发现的遗传和表观遗传的影响表明,缺氧可能对鱼类种群产生一个巨大而持久的威胁。调节精子发生的基因和表观遗传修饰在脊椎动物中是高度保守的,这些结果同时也揭示了缺氧在其他脊椎动物中潜在的遗传效应,包括人类。 材料与方法:材料:海洋青鳉鱼取材方法:性成熟的海洋青鳉鱼保持在常氧(normoxia)或缺氧(hypoxia)培育一个月。常氧的F1、F2代受精卵的仍保持常氧培育。缺氧组的受精卵在受精1h后收集,并分为两类,一类恢复常氧培育,并持续两代。另一类仍缺氧培育两代。 测序策略和分析流程:测序:Illumina HiSeq 2000分析:测定睾丸组织学改变、精子活力和受精成功率,分析精子的DNA甲基化模式(使用甲基化DNA免疫沉淀测序、MeDIP Seq),分析F0、F2代常氧、缺氧和跨代组的睾丸的差异表达基因(RNA-seq)和蛋白质组(采用Western blot和iTRAQ定量测定)。 研究结果:1、F0、F1、F2代生殖功能障碍。a、实验设计。b、F0、F1、F2代的精子活力。N、T、H代表常氧、跨代、缺氧组。VAP、平均路径速度;VCL、曲线运动速度;VSL、直线运动速度。可见,即使未缺氧,F1T、F2T的精子活力也明显下降。c、睾丸重量比较分析。d、精子细胞比例比较分析。 2、F0、F1、F2代睾丸中缺氧诱导的蛋白表达差异(DEPs)。同位素标记相对差异绝对定量(iT...
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发布时间: 2016 - 09 - 14
摘要:本文报道了全基因组单碱基分辨率下,镉胁迫水稻的甲基化的胞嘧啶和转录组的变化。在镉胁迫和无镉水稻基因组之间,CG和非CG的甲基化标记有广泛差异。检测到2320个非冗余的差异甲基化区域。RNA测序发现了2092个DNA甲基化修饰基因在镉胁迫下的差异表达。上游、下游、基因区,高甲基化(CG,CHH,CHG)的基因比低甲基化的基因更多。许多基因与应激反应、金属转运和转录因子有关。大多数的DNA甲基化修饰基因在镉胁迫下发生转录改变。在DNA甲基化和组蛋白修饰活性中的一个功能缺失的突变体子集,被用来确定选定的基因的转录丰度。相比于野生型,DRM2和MET1的突变导致镉胁迫后基因较低的转录水平,DRM2中OsIRO2、OsPR1b和Os09g02214的转录本明显减少。一种常用的DNA甲基化抑制剂,5-氮杂胞苷,被用来探讨DNA去甲基化是否产生生理后果。5-氮杂胞苷降低所选基因的DNA甲基化水平,但促进水稻幼苗生长和水稻镉积累。 材料:水稻(Oryza sativa ssp japonica cv. Nipponbare)取材方法:种子用5%次氯酸钠消毒,用蒸馏水彻底清洗。30℃、暗室孵育两天,种子萌发。随后,幼苗被转移至1.2L聚乙烯容器中,加入一半霍格兰营养液,暗室孵育两天。然后,又在14h光照(30℃)、10h黑暗(25℃)下,孵育两天。之后,进行0μM和 80μM的镉(硫酸镉)处理,pH 5.8,设三个生物学重复。对BS-seq和RNA-seq,80μM的镉(硫酸镉)处理四天。对长期实验,0μM和 5μM的镉处理一个月。 DNA提取:每个文库36个苗。QIAamp DNA Mini Kit。RNA提取:每个文库36个苗。TRIzol Reagent。共四个库(根、茎有无镉)。 测序:BS-seq(重亚硫酸盐测序):Illumina hiseq ...

表观遗传

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