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    发布时间: 2018 - 12 - 10
    英文标题:Selection and Validation of Novel RT-qPCR Reference Genes under Hormonal Stimuli and in Diferent Tissues of Santalum album杂志:Scientific  Reports影响因子:IF=4.122摘要   逆转录实时定量聚合酶链式反应 (RT-qPCR)因其高通量、特异性和敏感性而被广泛应用于基因表达水平的研究。为了获得准确可靠的结果,RT-qPCR分析必须有一个合适的参考基因。到目前为止,经济热带树种檀香((Santalum album L.)还没有被验证的可靠参考基因。在本研究中,有13个候选参考基因(包括从大量的檀香转录组数据中筛选出的12个新的可能的参考基因,以及目前使用的β-actin基因)在不同的组织(茎、叶、根和愈伤组织)、以及水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯 (MeJA)、赤霉素(GA)处理作用下的愈伤组织中,用GeNorm,NormFinder,BestKeeper,Delta CT和 RefFinder算法综合验证。几种新的候选参考基因比目前使用的传统基因ACT要稳定得多。SA处理中ODD和Fbp1、MeJA处理中的CSA 和Fbp3、JA处理中的PP2C和Fbp2、以及3个激素处理中FBP 1和FBP 2,分别是最准确的参考基因。当FAB1A与PP2C结合后,被鉴定为四种组织最适宜的参考基因组合。而HLMt, PPR和FAB1A的组合则是所有实验样本中最理想的参考基因。此外,为了验证我们的结果,我们还通过参考基因及他们的组合在MeJA处理下的三种檀香组织中评估了SaSSy基因的相对表达水平。本研究中所鉴定的参考基因将提高RT-qPCR分析的准确性,并将有...
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    发布时间: 2018 - 12 - 03
    发表期刊:Microbiome影响因子:9.133(SCI一区)研究背景最近几年,对肠道微生物群(GM)的研究已经不仅仅是描述分类组成,通常是将16S rRNA基因测序应用于粪便样本,更广泛地研究GM的功能潜力,这是通过鸟枪法宏基因组学(MG)方法实现的。群体MG研究表明,尽管存在较大的个体间结构/组成变异,GMs仍有一组稳定的核心功能。然而,由于测序的基因不一定表达,MG不能提供可靠的信息,说明哪些微生物的功能特征实际上在响应宿主代谢、免疫、神经生物学、饮食或其他环境因素的刺激而发生变化。相反,这类信息可以由功能宏组学收集,如宏转录组学(MT)和宏蛋白质组学(MP),它们对微扰具有较高的敏感性,因此可能更好地反映宿主微生物相互作用。在这方面,特别令人感兴趣的是调查人类群体中潜在的和实际活跃的GM特征之间的关系,为了从已知的MG的潜能开始鉴定在健康肠中组成型表达的微生物功能。最近的一项研究已经针对MT实现了这一目标,在具有最高表达率(mRNA/DNA比率)和参与淀粉代谢,氨基酸生物合成,孢子形成和以及具有最低表达率的肽聚糖生物合成的基因中发现了核糖体蛋白和柠檬酸循环酶的转录物。人们对微生物蛋白的了解较少,尽管它们提供了有关GM代谢的主要信息,并且代表了宿主-GM相互作用中的关键分子。尽管有一些开创性的研究提出了对疾病有关的人类群体中的宏基因组和宏蛋白组的分析,到目前为止,还没有系统地、比较地调查健康人群的分类学和功能特征,这种特征可能和实际由GM表达。材料与方法01实验设计图1本研究的实验设计注:从临床监测的撒丁岛人群中选出15名健康成人(男性7名,女性8名)。从每个人身上采集粪便样本,同时进行Illumina鸟枪法DNA测序(宏基因组)和LTQ-Orbitrap鸟枪法质谱分析(宏蛋白组)。宏基因组学也被用作序列数据库,以便进行严格的宏蛋白质组/宏基因组比较,并进行分类和功...
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    发布时间: 2018 - 11 - 26
    摘要全转录组范围内鉴定能与蛋白结合的RNA(RBPs),是了解转录后基因调控网络的必要条件。然而RBPs蛋白组的研究主要局限于多聚腺苷酸的RNA与蛋白的结合,对于没有ploy-A尾的RNA(主要的是非编码RNA和RNA前体)几乎都没发现。本文介绍了一种点击化学(主旨是通过小单元的拼接,来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。它尤其强调开辟以碳-杂原子键(C-X-C)合成为基础的组合化学新方法,并借助这些反应(点击反应)来简单高效地获得分子多样性。)辅助的RNA互作捕获策略(CARIC),能够对RBPs进行无差别鉴定,不受RNA是否具有ploy-A尾的约束。CARIC主要是利用炔基尿苷类似物对RNA进行标记,并在活体内进行RNA-protein光照交联,然后与叠氮化物生物素进行点击化学反应,亲和富集后进行蛋白组分析。利用CARIC在人的宫颈癌细胞中鉴定到597个RBPs,包括130个之前未知的RBPs。这些新发现的RBPs可能是和非编码RNA结合的,因此发现了一些之前未知的非编码RNA参与的过程(例如蛋白酶体功能和中间代谢)。材料方法实验材料:人的宫颈癌细胞,胚肾细胞;质粒构建和细胞转染:克隆宫颈癌细胞cDNA(hnRNPC,MBNL1,VDAC1,NME2),克隆质粒:VigoFect;几种已知RPBs用来验证CARIC技术成功率CARIC分离出的RNA测序:Illumina HisEq 4000 PE150;蛋白质谱检测:LC-MS/MS,Easy nLC 1000 system +Velos Pro Orbitrap Elite mass spectrometer;质谱数据分析:MaxQuant version 1.5.5.1(原始数据分析),依靠人的蛋白数据(UniProt)Andromeda search engine进行蛋白查询;CARIC RBPs验证:CLIP...
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    发布时间: 2018 - 11 - 09
    前沿慢性阻塞性肺病(COPD)是一种炎性疾病,其特征在于进行性空气流量限制,并且被认为部分地由于响应于慢性空气污染物暴露(主要来自吸烟)而引起的夸大的肺部炎症。目前可用的治疗方法在很大程度上是无效的。因此,有效治疗COPD迫切需要新型的治疗药物。前期系统药理学鉴定了补肺益肾方(BYF)的195种潜在靶点,并被证实对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠有短期治疗作用。然而,对慢性阻塞性肺疾病(COPD)的长期疗效及机制尚不清楚。因此,本研究以慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠为研究对象,于第9~20周给药。然后通过转录组学-蛋白质组学-代谢组学分析第32周BYF对慢性阻塞性肺病大鼠的长期影响。材料与方法样本收集第0-8周构建COPD大鼠模型,将32只大鼠置于一个暴露于烟草和反复肺炎克雷伯菌感染的封闭的盒子里,第9-20周大鼠每日灌胃给予生理盐水(2mL)、BYF(4.44g/kg,0.5g/ml)和氨茶碱(2.3mg/kg)。检测方法转录组:Microarray(4×44K)大鼠全基因组表达谱芯片;蛋白组:8-plex iTRAQ,NanoLC-QTOF-MS;代谢组:Agilent-1200 LC-Agilent-6520 Q-TOF;数据分析Agilent GeneSpring GX software version 11.0Mascot:蛋白质鉴定Mass Hunter:代谢物鉴定SIMCA-P:PLS-DA基因、蛋白质和代谢物集富集、网络和通路分析Bingo(CytosCapev3.1.1插件)用于分析转录本和蛋白质的分子功能;DAVID和KEGG数据库对转录本和蛋白质进行途径富集分析。Metscape用于分析基因、蛋白质和代谢组学数据的整合途径;ClueGO(Cytoscape插件被用来探索基因和蛋白的分子功能。MetaboAnalyst 3.0被用来确定代谢物...
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    发布时间: 2018 - 11 - 08
    砷暴露对小鼠肠道宏基因组和代谢谱的响应IF=8.3091.摘要背景:人类肠道是一个极其复杂、多样和庞大的微生物群落-肠道微生物群。肠道微生物群在代谢过程、能量产生、免疫和认知发育、上皮稳态等方面发挥着重要作用。然而,肠道微生物群的组成和多样性很容易受到外界因素的影响,这就增加了接触有毒环境化学物质导致肠道微生物群改变或失调的可能性。砷的暴露影响全世界的大量人口,并且与许多疾病有关,包括癌症,糖尿病和心血管疾病。目的:研究了砷暴露对肠道微生物组成及其代谢状况的影响。方法:采用16S rRNA基因测序和质谱代谢组学分析相结合的方法,研究砷暴露对肠道微生物群的功能影响。结果:16S rRNA基因测序结果表明,10 ppm砷暴露4周后,砷对C57BL/6小鼠肠道微生物组分有明显的干扰作用。此外,代谢组学图谱显示了一种并行效应,许多肠道菌群相关的代谢物在多个生物基质中被干扰。结论:砷的暴露不仅改变肠道微生物群落的丰度水平,而且在功能水平上也严重干扰其代谢状况。这些发现可能为肠道微生物群的微扰及其作为接触砷导致或加重人类疾病的潜在新机制的作用提供新的见解。2.材料和方法动物和处理:无特定病原体的C57BL/6雌性小鼠20只(6周龄,体重20±3g)。平均分为两组。两组小鼠在同样的环境条件下饲养,供给相同的食物和水。饲养到8周龄后,处理组:饮用水中注入无机砷(亚砷酸钠,10ppm)持续四周;对照组:依旧供给清水。在整个实验过程中,每天评估小鼠腹泻,脱水和身体状况恶化的情况。用砷4周后,用二氧化碳对小鼠实施安乐死并进行尸体剖检。对肝脏(左侧,内侧,右侧和尾状叶)和结肠(远端,横向和前期结肠)的多发区域的炎症,水肿,上皮缺损,高血浆和发育异常等指标进行评估。病理评分未显示对照组和砷治疗组小鼠之间存在任何显着差异,也未观察到体重,死亡率和食物摄入量的任何显着变化。16SrRNA测序数...
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    发布时间: 2018 - 10 - 30
    文章题目:A strategy for association study on intestinal microbiomeand brain metabolome across lifespan of rats.杂志:Analytical  Chemistry 影响因子:IF=6.0421摘要   人们越来越认识到微生物群-肠-脑轴在哺乳动物一生中对哺乳动物生长和健康的不同作用。大量研究表明,肠道微生物群及其代谢物广泛参与脑与肠的沟通。脑代谢组与肠道微生物的关联研究是一个活跃的领域,它提供了大量关于微生物、脑和肠道相互作用的信息,但数据大小和复杂的层次关系是形成重要的、可重复的结论的主要障碍。本研究采用多种分析平台和生物信息学方法,对雄性Wistar大鼠在生长过程中的脑代谢和肠道微生物群关联分析进行了两级策略的研究。轨迹分析表明,与年龄相关的脑代谢组和肠道微生物在总体变化模式上具有相似性。 四个高水平分类的相关对“代谢类型—细菌门”包含“脂质-螺旋菌”、“游离脂肪酸-厚壁菌门”、“胆汁酸-厚壁菌门”、“神经递质-拟杆菌门”在单元-多元相关分析和功能分析的基础上被筛选出。进一步鉴定了上述高水平关键对中的四组特异性“代谢产物-细菌”关联对。通过一项独立的动物研究验证了关键相关对的有效性。这种两级策略有效地识别了从系统多组学研究中获得的大数据集中的主要相关性,加深我们对大脑和肠道之间终生联系的理解。材料与方法动物材料:正常生长实验取出生后第1、3、7、12、24、56、111周的雄性大鼠全脑和肠内容物,每组6只,共42只。      在限制饮食验证实验中,12只雄性大鼠(4周龄)被喂食3周,然后6只(随机选择)饲喂Libitum,其余6只饲喂60%的Libitum 5周...
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集思慧远客户发表文章《褪黑素对水稻白叶枯病菌生长的抑制作用》

日期: 2018-10-26
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集思慧远客户发表文章《褪黑素对水稻白叶枯病菌生长的抑制作用》

集思慧远客户发表文章《褪黑素对水稻白叶枯病菌生长的抑制作用》

水稻白叶枯病(Xoo)引起水稻细菌性疫病(BB),是世界各地水稻生长最广泛、危害最严重的病害之一。褪黑素通过诱导植物天然免疫增强病原菌抗性,但褪黑素对植物致病菌的直接作用尚不清楚。本论文研究了褪黑素对Xoo的直接作用,结果表明外源性褪黑素200μg/mL可明显抑制Xoo的增殖,降低5个细胞分裂相关基因的mRNA表达。这种浓度的褪黑素也抑制了Xoo的运动和生物膜的形成。值得注意的是,褪黑素可以改变Xoo细胞的长度。为了更深入地了解这种抗菌作用的机制,本研究采用RNA-Seq检测了200μg/mL褪黑素对Xoo菌株PXO99全局基因表达的影响。褪黑素处理后,Xoo细胞中与催化活性和金属结合活性相关的差异表达基因(DEGS)被下调。此外,对碳水化合物和氨基酸代谢的DEGs也受到下调。这些结果提示褪黑素抑制Xoo增殖的机制可能涉及调节细胞分裂,同时降低参与新陈代谢的酶的浓度或活性。


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材料与方法


细菌菌株与植物

采用剪叶法对水稻叶片接种Xoo菌株PXO99进行致病性试验。用无针注射器法对烟叶接种PXO99进行过敏反应(HR)监测。

褪黑素对细菌生长影响的测定

对不同浓度(0、200、400或1000μg/mL)褪黑素及无褪黑素(0μg/mL)的甲醇(MeOH)溶剂处理的细菌菌株每3h测定一次OD600,直至细菌生长达到静止阶段。每个实验进行三次,每个实验重复三次。

透射电镜观察

对不同浓度(0、200或400μg/mL)褪黑素及无褪黑素(0μg/mL)的甲醇(MeOH)溶剂处理的细菌标本做阴性染色,然后用相机拍摄。

细胞运动和生物膜形成的测定

对不同浓度(0、10、40或250μg/mL)褪黑素及无褪黑素(0μg/mL)的甲醇(MeOH)溶剂处理的Xoo菌株PXO99进行细胞运动和生物膜测定,每个实验进行三次,每次实验分别重复五次和六次。

内源性褪黑素的测定

利用LC-MS对不同浓度褪黑素(0或200μg/mL)处理的Xoo菌株PXO99进行内源性褪黑素含量的检测。

RNA测序与数据分析

不同处理:MOH(M0)和200μg/mL褪黑素(M200)

检测平台:Illumina HiSeq Xten

差异基因筛选条件:log2FC>2,p<0.01

实时荧光定量

采用qRT-PCR技术对选取的18个基因进行了验证分析。

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结果与讨论

01

褪黑素抑制Xoo生长

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1褪黑素抑制Xoo的生长

注:(A)在褪黑素处理下,PXO99的状况。(B)对不同浓度褪黑素(μg/mL)处理后培养24h的PXO99生长曲线进行统计分析。


甲醇(模拟对照)和不同浓度褪黑素处理的Xoo细菌生长速率(图1A)。褪黑素(200μg/mL)预处理24h后,PXO99的OD600值约为1.0,仅为对照组的一半(图1B)。因此,200μg/mL的褪黑素能有效地抑制PXO99的生长。当浓度升高时,细菌密度显示出更大的降低。褪黑激素在一定浓度下抑制人类致病细菌的生长,包括在2µg/mL的无乳链球菌和1000µg/mL的酿酒酵母中。生长抑制结果表明,褪黑素以浓度依赖性的方式抑制PXO99的生长,其抑制作用可能是剂量依赖性的。

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02

褪黑素减少Xoo泳动能力但增加生物膜形成

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图2褪黑素处理对Xoo泳动力(A)和生物膜形成(B)影响的统计分析


为研究褪黑素对细菌运动的影响,测定了褪黑素存在和不存在时Xoo的游动直径。由于观察到较高浓度的褪黑素破坏了Xoo的泳动能力。因此,在随后的试验中,褪黑素的用量不超过200µg/mL。如图2A所示,10µg/mL褪黑素平板的菌落直径比模拟对照减少了30%以上。随着褪黑素浓度的增加,泳动直径进一步减小。200µg/mLL褪黑素平板的菌落直径比模拟对照减少一半以上。因此,褪黑素以浓度依赖性的方式影响Xoo的运动。这些结果显示褪黑素对细菌运动的抑制作用可能是通过增加细胞死亡来实现的,尽管有必要对此进行进一步的研究。

为评价褪黑素对Xoo附着的影响,分析了PXO99在褪黑素挑战下的生物膜形成情况。如图2B所示,10μg/mL褪黑素的存在稍微增加了PXO99的生物膜形成。当褪黑素浓度增加时,OD595处的CV吸光度增加幅度较大。观察到的含有40μg/mL褪黑激素的管的OD595值比模拟对照高三倍。然而,当褪黑素存在于高浓度时,则观察到相反的效果。在含褪黑素200μg/mL的试管中,OD595值比对照组低40%。因此,褪黑素对PXO99生物膜形成的影响与观察到的对游动或生长抑制的影响不相似。当褪黑素浓度较高时,无游动或生物膜形成。结果表明,低浓度褪黑素可诱导Xoo形成生物膜,高浓度时则抑制其形成。

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03

Xoo因褪黑素而高度富集

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图3 Xoo中褪黑素的提取与鉴定

注:(A)与褪黑素相对应的色谱图。(a)与未使用褪黑激素(Sigma)处理的PxO99细胞收集的褪黑素相对应的色谱图。(b)用褪黑素(Sigma)预处理PXO99细胞收集的褪黑素相对应的色谱图。(B)PXO99细胞褪黑素(ng/cells)的统计分析。紫外响应:280nm


利用LC-MS测定了褪黑素对PXO99细胞内源性褪黑素含量的影响。30mL培养液培养24h后,POX99细胞内源性褪黑素为14.43ng。与外源性褪黑素共同孵育的POX99细胞培养24h后,从30mL培养液中分离得到内源性褪黑素156.13ng(图3A)。结果表明,褪黑素可以很容易地穿过细胞壁,并在Xoo细胞中富集。处理组内源性褪黑素约为对照组的100倍(图3B)。这种破坏正常内源性褪黑素水平的Xoo可能会抑制这种细菌的增殖。

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04

褪黑素抑制Xoo细胞分裂

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图4褪黑素作用下Xoo细胞分裂相关基因mRNA表达的qRT-PCR分析


为探讨褪黑素是否通过干扰或抑制细胞分裂而抑制细菌增殖,用qRT-PCR方法检测了褪黑素(200μg/mL)对PXO99细胞分裂相关基因的mRNA表达。如图4所示,与对照组相比,褪黑素处理的Xoo细胞中有4个细胞分裂相关基因(FetQ、ZapE、FetL和FetE)被上调,5种基因(ZipA、FetB、ZapA、FetD和FetZ)表达下调。结果表明,褪黑素处理导致Xoo细胞分裂减少。因为细菌的增殖取决于细胞的分裂能力,在细胞分裂过程中,Xoo的生长受到抑制。

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05

褪黑素改变Xoo形态

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图5褪黑素处理Xoo形态的观察

注:(A)PXO99细胞的形态:(A)不经褪黑素处理的PXO99细胞的形态;(B)褪黑素处理的PXO99细胞的形态(200μg/mL)。(B)对PXO99细胞宽度和长度的统计分析。Bar=0.5m。


本研究通过透射电镜观察褪黑素对PXO99细胞形态的影响。如图5所示,使用负染色法通过TEM容易地区分细菌大小和形状。单个PXO99细胞的宽度和长度分别为0.6至1.0µm和1.0至2.7µm(图5A)。相比之下,褪黑素处理的PXO99细胞的宽度略短于对照组,200μg/mL的褪黑素处理的PXO99细胞的长度与对照相比明显减少(20%)(图5B)。这些数据表明褪黑素处理后PXO99细胞长度的减少可能是由于抑制Xoo增殖所致。

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06

褪黑素处理Xoo的RNA-Seq转录体分析

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为进一步探讨褪黑素对Xoo增殖的影响机制,收集了褪黑素处理或未处理的PXO99细胞的总RNA,并进行了RNA-Seq分析。通过对RNA-seq检测得到的基因表达变化的分析表明,138个基因在处理后21h对褪黑素的刺激下,mRNA转录水平发生了改变(表1),相当于Xoo基因组的2.73%。共有14个上调基因,124个下调基因,并且这些DEGs通过GO数据库来表征,GO数据库提供关于细胞组分,分子功能和生物过程的注释信息,并通过KEGG数据库注释。其中,在14个上调基因中,4个在鞭毛成分中富集,4个在转运活性上富集,3个参与代谢过程。

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图6基因本体论(GO)富集和细胞图谱对差异表达基因的分类

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7通过qRT-PCRmRNA水平上对18个差异表达基因的验证


在观察到的下调基因中,与细胞膜和细胞成分相关的基因在细胞成分类别中有明显的过度表达(图6A)。此外,编码催化活性相关蛋白的基因在分子功能类别中被过度表达(图6B)。一致地,观察到与生物过程类别中的代谢过程相关的基因的显著过度表达(图6C)。在代谢过程中,有41个基因在生物过程中占主导地位(图6C)。催化活性和金属结合活性分别有56个和27个基因在分子功能类别中占主导地位(图6B)。为验证转录产物的可靠性,采用qRT-PCR技术对随机选取的18个基因进行了分析,结果与测序数据一致(图7)。在褪黑素处理的PXO99中,与氧化磷酸化、柠檬酸循环、蛋白质分泌和双组分系统相关的基因被下调。

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07

褪黑素调节Xoo代谢

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图8褪黑素处理下PXO99代谢差异基因的分类


代谢是细菌的一个重要特征,据报道褪黑素能显著降低微生物代谢相关基因的mRNA表达。在这项研究中,我们观察到参与碳水化合物和氨基酸代谢的基因是丰富的(图8)。Xoo生长的最佳碳源和氮源是蔗糖和谷氨酸。有趣的是,参与异生物代谢的18个基因被下调(图8)。褪黑素具有很强的结合铜和铁(III)的能力。因此,我们推测褪黑素可以导致细菌细胞游离铁缺乏,并通过抑制褪黑素的金属结合活性或通过降低金属结合酶的浓度和活性来抑制生长。此外,位于细胞膜上与磷酸转运蛋白和参与能量代谢的磷酸盐结合蛋白相关的DEGs编码蛋白均被下调(图8)。

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结论

本研究探讨了褪黑素对稻瘟病菌(X.oryzae,PV.Oryzae)的潜在作用。我们的数据显示褪黑素可以穿过细胞壁,在Xoo细胞中富集,抑制这种细菌的细胞分裂和增殖。重要的是,褪黑素改变了细胞结构,降低了Xoo细胞的泳动能力和附着能力。转录组分析结果提示褪黑素对Xoo增殖的抑制作用可能是通过(1)减少细胞分裂,(2)降低代谢相关酶的浓度和活性来实现的。本工作为进一步了解褪黑素对细菌生长和基因表达的抑制作用提供了新的思路。




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