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    发布时间: 2018 - 12 - 10
    英文标题:Selection and Validation of Novel RT-qPCR Reference Genes under Hormonal Stimuli and in Diferent Tissues of Santalum album杂志:Scientific  Reports影响因子:IF=4.122摘要   逆转录实时定量聚合酶链式反应 (RT-qPCR)因其高通量、特异性和敏感性而被广泛应用于基因表达水平的研究。为了获得准确可靠的结果,RT-qPCR分析必须有一个合适的参考基因。到目前为止,经济热带树种檀香((Santalum album L.)还没有被验证的可靠参考基因。在本研究中,有13个候选参考基因(包括从大量的檀香转录组数据中筛选出的12个新的可能的参考基因,以及目前使用的β-actin基因)在不同的组织(茎、叶、根和愈伤组织)、以及水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯 (MeJA)、赤霉素(GA)处理作用下的愈伤组织中,用GeNorm,NormFinder,BestKeeper,Delta CT和 RefFinder算法综合验证。几种新的候选参考基因比目前使用的传统基因ACT要稳定得多。SA处理中ODD和Fbp1、MeJA处理中的CSA 和Fbp3、JA处理中的PP2C和Fbp2、以及3个激素处理中FBP 1和FBP 2,分别是最准确的参考基因。当FAB1A与PP2C结合后,被鉴定为四种组织最适宜的参考基因组合。而HLMt, PPR和FAB1A的组合则是所有实验样本中最理想的参考基因。此外,为了验证我们的结果,我们还通过参考基因及他们的组合在MeJA处理下的三种檀香组织中评估了SaSSy基因的相对表达水平。本研究中所鉴定的参考基因将提高RT-qPCR分析的准确性,并将有...
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    发布时间: 2018 - 12 - 03
    发表期刊:Microbiome影响因子:9.133(SCI一区)研究背景最近几年,对肠道微生物群(GM)的研究已经不仅仅是描述分类组成,通常是将16S rRNA基因测序应用于粪便样本,更广泛地研究GM的功能潜力,这是通过鸟枪法宏基因组学(MG)方法实现的。群体MG研究表明,尽管存在较大的个体间结构/组成变异,GMs仍有一组稳定的核心功能。然而,由于测序的基因不一定表达,MG不能提供可靠的信息,说明哪些微生物的功能特征实际上在响应宿主代谢、免疫、神经生物学、饮食或其他环境因素的刺激而发生变化。相反,这类信息可以由功能宏组学收集,如宏转录组学(MT)和宏蛋白质组学(MP),它们对微扰具有较高的敏感性,因此可能更好地反映宿主微生物相互作用。在这方面,特别令人感兴趣的是调查人类群体中潜在的和实际活跃的GM特征之间的关系,为了从已知的MG的潜能开始鉴定在健康肠中组成型表达的微生物功能。最近的一项研究已经针对MT实现了这一目标,在具有最高表达率(mRNA/DNA比率)和参与淀粉代谢,氨基酸生物合成,孢子形成和以及具有最低表达率的肽聚糖生物合成的基因中发现了核糖体蛋白和柠檬酸循环酶的转录物。人们对微生物蛋白的了解较少,尽管它们提供了有关GM代谢的主要信息,并且代表了宿主-GM相互作用中的关键分子。尽管有一些开创性的研究提出了对疾病有关的人类群体中的宏基因组和宏蛋白组的分析,到目前为止,还没有系统地、比较地调查健康人群的分类学和功能特征,这种特征可能和实际由GM表达。材料与方法01实验设计图1本研究的实验设计注:从临床监测的撒丁岛人群中选出15名健康成人(男性7名,女性8名)。从每个人身上采集粪便样本,同时进行Illumina鸟枪法DNA测序(宏基因组)和LTQ-Orbitrap鸟枪法质谱分析(宏蛋白组)。宏基因组学也被用作序列数据库,以便进行严格的宏蛋白质组/宏基因组比较,并进行分类和功...
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    发布时间: 2018 - 11 - 26
    摘要全转录组范围内鉴定能与蛋白结合的RNA(RBPs),是了解转录后基因调控网络的必要条件。然而RBPs蛋白组的研究主要局限于多聚腺苷酸的RNA与蛋白的结合,对于没有ploy-A尾的RNA(主要的是非编码RNA和RNA前体)几乎都没发现。本文介绍了一种点击化学(主旨是通过小单元的拼接,来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。它尤其强调开辟以碳-杂原子键(C-X-C)合成为基础的组合化学新方法,并借助这些反应(点击反应)来简单高效地获得分子多样性。)辅助的RNA互作捕获策略(CARIC),能够对RBPs进行无差别鉴定,不受RNA是否具有ploy-A尾的约束。CARIC主要是利用炔基尿苷类似物对RNA进行标记,并在活体内进行RNA-protein光照交联,然后与叠氮化物生物素进行点击化学反应,亲和富集后进行蛋白组分析。利用CARIC在人的宫颈癌细胞中鉴定到597个RBPs,包括130个之前未知的RBPs。这些新发现的RBPs可能是和非编码RNA结合的,因此发现了一些之前未知的非编码RNA参与的过程(例如蛋白酶体功能和中间代谢)。材料方法实验材料:人的宫颈癌细胞,胚肾细胞;质粒构建和细胞转染:克隆宫颈癌细胞cDNA(hnRNPC,MBNL1,VDAC1,NME2),克隆质粒:VigoFect;几种已知RPBs用来验证CARIC技术成功率CARIC分离出的RNA测序:Illumina HisEq 4000 PE150;蛋白质谱检测:LC-MS/MS,Easy nLC 1000 system +Velos Pro Orbitrap Elite mass spectrometer;质谱数据分析:MaxQuant version 1.5.5.1(原始数据分析),依靠人的蛋白数据(UniProt)Andromeda search engine进行蛋白查询;CARIC RBPs验证:CLIP...
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    发布时间: 2018 - 11 - 09
    前沿慢性阻塞性肺病(COPD)是一种炎性疾病,其特征在于进行性空气流量限制,并且被认为部分地由于响应于慢性空气污染物暴露(主要来自吸烟)而引起的夸大的肺部炎症。目前可用的治疗方法在很大程度上是无效的。因此,有效治疗COPD迫切需要新型的治疗药物。前期系统药理学鉴定了补肺益肾方(BYF)的195种潜在靶点,并被证实对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠有短期治疗作用。然而,对慢性阻塞性肺疾病(COPD)的长期疗效及机制尚不清楚。因此,本研究以慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠为研究对象,于第9~20周给药。然后通过转录组学-蛋白质组学-代谢组学分析第32周BYF对慢性阻塞性肺病大鼠的长期影响。材料与方法样本收集第0-8周构建COPD大鼠模型,将32只大鼠置于一个暴露于烟草和反复肺炎克雷伯菌感染的封闭的盒子里,第9-20周大鼠每日灌胃给予生理盐水(2mL)、BYF(4.44g/kg,0.5g/ml)和氨茶碱(2.3mg/kg)。检测方法转录组:Microarray(4×44K)大鼠全基因组表达谱芯片;蛋白组:8-plex iTRAQ,NanoLC-QTOF-MS;代谢组:Agilent-1200 LC-Agilent-6520 Q-TOF;数据分析Agilent GeneSpring GX software version 11.0Mascot:蛋白质鉴定Mass Hunter:代谢物鉴定SIMCA-P:PLS-DA基因、蛋白质和代谢物集富集、网络和通路分析Bingo(CytosCapev3.1.1插件)用于分析转录本和蛋白质的分子功能;DAVID和KEGG数据库对转录本和蛋白质进行途径富集分析。Metscape用于分析基因、蛋白质和代谢组学数据的整合途径;ClueGO(Cytoscape插件被用来探索基因和蛋白的分子功能。MetaboAnalyst 3.0被用来确定代谢物...
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    发布时间: 2018 - 11 - 08
    砷暴露对小鼠肠道宏基因组和代谢谱的响应IF=8.3091.摘要背景:人类肠道是一个极其复杂、多样和庞大的微生物群落-肠道微生物群。肠道微生物群在代谢过程、能量产生、免疫和认知发育、上皮稳态等方面发挥着重要作用。然而,肠道微生物群的组成和多样性很容易受到外界因素的影响,这就增加了接触有毒环境化学物质导致肠道微生物群改变或失调的可能性。砷的暴露影响全世界的大量人口,并且与许多疾病有关,包括癌症,糖尿病和心血管疾病。目的:研究了砷暴露对肠道微生物组成及其代谢状况的影响。方法:采用16S rRNA基因测序和质谱代谢组学分析相结合的方法,研究砷暴露对肠道微生物群的功能影响。结果:16S rRNA基因测序结果表明,10 ppm砷暴露4周后,砷对C57BL/6小鼠肠道微生物组分有明显的干扰作用。此外,代谢组学图谱显示了一种并行效应,许多肠道菌群相关的代谢物在多个生物基质中被干扰。结论:砷的暴露不仅改变肠道微生物群落的丰度水平,而且在功能水平上也严重干扰其代谢状况。这些发现可能为肠道微生物群的微扰及其作为接触砷导致或加重人类疾病的潜在新机制的作用提供新的见解。2.材料和方法动物和处理:无特定病原体的C57BL/6雌性小鼠20只(6周龄,体重20±3g)。平均分为两组。两组小鼠在同样的环境条件下饲养,供给相同的食物和水。饲养到8周龄后,处理组:饮用水中注入无机砷(亚砷酸钠,10ppm)持续四周;对照组:依旧供给清水。在整个实验过程中,每天评估小鼠腹泻,脱水和身体状况恶化的情况。用砷4周后,用二氧化碳对小鼠实施安乐死并进行尸体剖检。对肝脏(左侧,内侧,右侧和尾状叶)和结肠(远端,横向和前期结肠)的多发区域的炎症,水肿,上皮缺损,高血浆和发育异常等指标进行评估。病理评分未显示对照组和砷治疗组小鼠之间存在任何显着差异,也未观察到体重,死亡率和食物摄入量的任何显着变化。16SrRNA测序数...
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    发布时间: 2018 - 10 - 30
    文章题目:A strategy for association study on intestinal microbiomeand brain metabolome across lifespan of rats.杂志:Analytical  Chemistry 影响因子:IF=6.0421摘要   人们越来越认识到微生物群-肠-脑轴在哺乳动物一生中对哺乳动物生长和健康的不同作用。大量研究表明,肠道微生物群及其代谢物广泛参与脑与肠的沟通。脑代谢组与肠道微生物的关联研究是一个活跃的领域,它提供了大量关于微生物、脑和肠道相互作用的信息,但数据大小和复杂的层次关系是形成重要的、可重复的结论的主要障碍。本研究采用多种分析平台和生物信息学方法,对雄性Wistar大鼠在生长过程中的脑代谢和肠道微生物群关联分析进行了两级策略的研究。轨迹分析表明,与年龄相关的脑代谢组和肠道微生物在总体变化模式上具有相似性。 四个高水平分类的相关对“代谢类型—细菌门”包含“脂质-螺旋菌”、“游离脂肪酸-厚壁菌门”、“胆汁酸-厚壁菌门”、“神经递质-拟杆菌门”在单元-多元相关分析和功能分析的基础上被筛选出。进一步鉴定了上述高水平关键对中的四组特异性“代谢产物-细菌”关联对。通过一项独立的动物研究验证了关键相关对的有效性。这种两级策略有效地识别了从系统多组学研究中获得的大数据集中的主要相关性,加深我们对大脑和肠道之间终生联系的理解。材料与方法动物材料:正常生长实验取出生后第1、3、7、12、24、56、111周的雄性大鼠全脑和肠内容物,每组6只,共42只。      在限制饮食验证实验中,12只雄性大鼠(4周龄)被喂食3周,然后6只(随机选择)饲喂Libitum,其余6只饲喂60%的Libitum 5周...
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比较代谢组学揭示喜马拉雅山两种濒危红豆杉的代谢差异

日期: 2018-09-27
浏览次数: 52
比较代谢组学揭示喜马拉雅山两种濒危红豆杉的代谢差异

发表期刊:BMC Plant Biology

影响因子:3.930(SCI二区)

比较代谢组学揭示喜马拉雅山两种濒危红豆杉的代谢差异
比较代谢组学揭示喜马拉雅山两种濒危红豆杉的代谢差异
研究背景

红豆杉属植物由于其天然产物紫杉醇是一种成功的抗癌药物而备受关注。密叶红豆杉T. fuana和云南红豆杉T. yunnanensis是分布在喜马拉雅山上两种濒危红豆杉品种。近年来,紫杉醇的市场需求超过供应,受到几个限制条件的限制,如红豆杉生长缓慢、紫杉醇含量低和合成路线复杂。目前紫杉醇的生物合成途径已经被揭示,产生了大量的紫杉醇前体、中间体和衍生物。

到目前为止,已鉴定出红豆杉属14种植物,但不同品种和品种间积累的紫杉醇含量差异很大。对这两种形态相似的红豆杉种类之间的紫杉醇类化合物以及其他次级代谢产物的种间差异性积累的代谢特征的研究将促进高产品种的繁育,并揭示物种和环境依赖的代谢变化的机制。本研究可为这两种濒危红豆杉种质资源的保存提供有价值的信息。

比较代谢组学揭示喜马拉雅山两种濒危红豆杉的代谢差异
比较代谢组学揭示喜马拉雅山两种濒危红豆杉的代谢差异
材料与方法

1.植物材料

分别采自西藏吉隆和西藏墨脱15株独立的10年生密叶红豆杉T. fuana和云南红豆杉T. yunnanensis的新鲜小枝(图1a),吉隆平均海拔4000米,莫陀岛平均海拔1200米。

2.非靶标代谢组学

样品:两种红豆杉新鲜枝条样本25mg,设置15个生物重复(15株)。

检测平台:UPLC-Triple-TOF-5600+(AB SCIEX)Q,采用DIA数据采集模式。此外,每10个样品分析一次QC样品。

3.生物信息学分析

数据预处理:XCMS软件;

代谢物匹配:KEGG、HMDB数据库(10ppm);

数据过滤:在不到50%的QC样品或80%的生物样品中检测到的特征被去除,并利用k近邻算法对缺失值的剩余峰值进行估计,进一步提高数据质量。此外,计算所有QC样品中代谢特征的相对标准偏差,然后去除那些>30%的相对标准偏差。

4.紫杉醇类化合物和黄酮类化合物靶标测定

样品:分别从两种红豆杉的6棵树采集新鲜枝条,样品在40℃下完全干燥,然后研磨成粉末;

检测平台:LC-30 AD UPLC-QTRAP 6500;多反应监测(MRM)用于正电离模式下测定紫杉醇类化合物,正、负离子模式下测定黄酮类化合物。

数据采集软件:MultiQuant软件(3.0版)


比较代谢组学揭示喜马拉雅山两种濒危红豆杉的代谢差异
比较代谢组学揭示喜马拉雅山两种濒危红豆杉的代谢差异
结果

01

两种濒危红豆杉的非靶标代谢分析

比较代谢组学揭示喜马拉雅山两种濒危红豆杉的代谢差异

1非靶向代谢物谱显示了云南红豆杉T.yunnanensis和密叶红豆杉T.fuana之间代谢物丰度的变化

注:a.密叶红豆杉植物枝条;b.用绿色小点和红色小点分别指示了密叶红豆杉T.fuana(吉隆)和云南红豆杉T.yunnanensis(墨脱)的采集点。(C)云南红豆杉植物枝条。d.两种红豆杉中所鉴定代谢物的热图(n=15)


采用非靶向代谢组学方法(n=15),从7,251个离子特征中鉴定出4,986种代谢物。图1d显示了两种红豆杉代谢物谱的概况。与树枝形态的相似性不同,结果表明,两种红豆杉的代谢体发生了显著的变化。

以鉴定到的代谢物被划分为至少一个一级或二级代谢类别。最大的20个代谢类别,如卟啉和叶绿素代谢(134个代谢物),2-氧羧酸代谢(134个代谢物),氨基酸生物合成(127个代谢物),ABC转运蛋白(126种代谢物)、二萜类生物合成(103种代谢物)和其他次级代谢物(141种)。

02

代谢物谱显示了两种红豆杉代谢物丰度的变化

比较代谢组学揭示喜马拉雅山两种濒危红豆杉的代谢差异

2密叶红豆杉云南红豆杉差异代谢物的鉴定

注:a.火山图展示两种红豆杉的差异代谢物。b.两种红豆杉在每一种代谢物类别中的代谢物数量c.不同代谢类别的差异代谢物的数量


为了提供代谢变化的深入概述,分析了用于量化的若干质量控制参数,包括变异系数(CV),主成分(PC)和归一化强度。过滤后,用4,986种优质代谢物筛选出差异代谢物(DAMS)(图2a)。统计分析确定了1,972个差异代谢物,云南红豆杉和密叶红豆杉分别为788和1,184个。

所有的DAMS都属于各种主要的代谢类别,包括生物碱、氨基酸、黄酮类化合物、激素、脂类、萜类化合物、苯丙类化合物、糖类等。在大多数这类植物中,两种红豆杉的主要积累的代谢物数量相似。例如,以萜类化合物为主的密叶红豆杉的数量与云南红豆杉的萜类化合物的数量相似(图2b)。在密叶红豆杉中测定了47个黄酮类化合物,而在云南红豆杉中仅测定到了14种黄酮类化合物。每种代谢物的归一化离子强度都是计算出来的,如图2c所示。

03

紫杉醇前体、中间体和竞争者的代谢物丰度变化

比较代谢组学揭示喜马拉雅山两种濒危红豆杉的代谢差异

3紫杉醇的前体、中间产物和竞争的丰度变化

注:a.紫杉醇生物合成途径。b.这两种红豆杉中紫杉醇的前体、中间体、竞争者的相对数量的热图。来自MEP途径的前体被包含在一个红色的盒子里,中间体和衍生物被包含在一个紫色的盒子里,而紫杉醇的竞争者被包含在一个绿色的盒子里。


紫杉醇生物合成是一个复杂的代谢途径,涉及大量次生代谢物,包括紫杉醇的前体、中间体和竞争者(图3a)。结果表明,前体在密叶红豆杉和云南红豆杉中的积累量无显著差异,而紫杉醇主要积累在云南红豆杉中。有趣的是,大多数中间产物是在云南红豆杉中大量积累的,而类紫杉醇代谢物则大量积累在密叶红豆杉中(图3b)。

04

靶标定量分析证实了紫杉醇类化合物的变异

比较代谢组学揭示喜马拉雅山两种濒危红豆杉的代谢差异

4密叶红豆杉和云南红豆杉紫杉醇类物质含量的测定

注:a.采用UPLC-MS/MS法测定紫杉醇和6种中间体的含量P<0.001被认为具有统计学意义,并以“*”表示。b.正离子模式下云南红豆杉和密叶红豆杉紫杉醇的代表性色谱图。c.正离子模式下云南红豆杉密叶红豆杉6种中间体的代表性色谱图


为了准确评估紫杉醇及其衍生物的含量差异,用UPLCMS/MS方法对7种紫杉醇类化合物进行量化测定。非靶向代谢组学分析表明紫杉醇主要在云南红豆杉中积累,紫杉醇直接量化的真实标准证实了这种现象。云南红豆杉的紫杉醇的含量(0.084mg/g)是密叶红杉(0.027mg/g)的3.1倍。此外,与密叶红豆杉相比,其他6种中间体都在云南红豆杉中显著积累(图4A)。图4b和图c显示了密叶红豆杉和云南红豆杉的这些紫杉醇类化合物的代表性TIC色谱图。

05

黄酮类化合物丰度的变化

比较代谢组学揭示喜马拉雅山两种濒危红豆杉的代谢差异

5黄酮类和异黄酮类化合物的相对含量热图


迄今为止,已从各种红豆杉种中分离出大量黄酮类化合物。在我们的研究中,鉴定了参与类黄酮生物合成的35种代谢物和涉及异黄酮生物合成的17种代谢物。对于类黄酮生物合成,与云南红豆杉相比,除了叶黄素,黄腐酚和隐色花翠素外,大多数代谢物在密叶红豆杉中显著积累。对于异黄酮类生物合成,与云南红豆杉相比,除了美迪紫檀素,假靛黄素,和大豆苷元外,大多数代谢物主要在密叶红豆杉中积累(图5)。

06

定量分析证实了黄酮类化合物的变异

比较代谢组学揭示喜马拉雅山两种濒危红豆杉的代谢差异

6两种红豆杉中总黄酮和单黄酮含量的测定

注:a.密叶红豆杉和云南红豆杉中总黄酮的含量。b.研究了两种红豆杉8种黄酮类化合物的含量。P<0.001被认为是有统计学意义,并以“*”表示。c.负离子模式下模式下单个黄酮类化合物的色谱图。d.正离子模式下模式下单个黄酮类化合物的色谱图。


对总黄酮和8种黄酮,包括芹菜素、木犀草素、山奈酚、槲皮素、(+)-儿茶素、(−)-表儿茶素、异黄酮和银杏素的含量进行了测定。总黄酮含量在密叶红豆杉中显著高于云南红豆杉(图6a)。类似地,大多数黄酮类化合物(包括芹菜素、木犀草素、山奈酚、槲皮素、异黄酮和银杏素)主要积累在云南红豆杉中。只有(+)-儿茶素和(−)-表儿茶素两种黄酮类化合物主要在云南红豆杉中积累,而不是在密叶红豆杉中积累(图6b)。两种红豆杉样品中这些黄酮类化合物的代表性TIC色谱图如图6c和d所示。

比较代谢组学揭示喜马拉雅山两种濒危红豆杉的代谢差异
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总结

本试验采用代谢组学研究了在不同环境中生长的两种濒危物种:密叶红豆杉T.fuana和云南红豆杉T.yunnanensis新鲜枝条的代谢变异。总共鉴定出了属于不同代谢类别的4,986种代谢物。云南红豆杉T.Yunnanensis的紫杉醇含量显著高于密叶红豆杉T.fuana。所有已鉴定的紫杉醇生物合成中间体主要集中在云南红豆杉T.yunnanensis,而四种与紫杉醇生物合成有关的竞争者主要集中在密叶红豆杉T.fuana。此外,密叶红豆杉T.fuana中总黄酮和单个类黄酮的含量均显著高于云南红豆杉T.Yunnanensis。本研究为不同环境下两种濒危红豆杉种质资源的综合利用和保存提供了有价值的信息。


点击原文链接:https://doi.org/10.1186/s12870-018-1412-4查看论文全文。



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