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    发布时间: 2018 - 12 - 10
    英文标题:Selection and Validation of Novel RT-qPCR Reference Genes under Hormonal Stimuli and in Diferent Tissues of Santalum album杂志:Scientific  Reports影响因子:IF=4.122摘要   逆转录实时定量聚合酶链式反应 (RT-qPCR)因其高通量、特异性和敏感性而被广泛应用于基因表达水平的研究。为了获得准确可靠的结果,RT-qPCR分析必须有一个合适的参考基因。到目前为止,经济热带树种檀香((Santalum album L.)还没有被验证的可靠参考基因。在本研究中,有13个候选参考基因(包括从大量的檀香转录组数据中筛选出的12个新的可能的参考基因,以及目前使用的β-actin基因)在不同的组织(茎、叶、根和愈伤组织)、以及水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯 (MeJA)、赤霉素(GA)处理作用下的愈伤组织中,用GeNorm,NormFinder,BestKeeper,Delta CT和 RefFinder算法综合验证。几种新的候选参考基因比目前使用的传统基因ACT要稳定得多。SA处理中ODD和Fbp1、MeJA处理中的CSA 和Fbp3、JA处理中的PP2C和Fbp2、以及3个激素处理中FBP 1和FBP 2,分别是最准确的参考基因。当FAB1A与PP2C结合后,被鉴定为四种组织最适宜的参考基因组合。而HLMt, PPR和FAB1A的组合则是所有实验样本中最理想的参考基因。此外,为了验证我们的结果,我们还通过参考基因及他们的组合在MeJA处理下的三种檀香组织中评估了SaSSy基因的相对表达水平。本研究中所鉴定的参考基因将提高RT-qPCR分析的准确性,并将有...
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    发布时间: 2018 - 12 - 03
    发表期刊:Microbiome影响因子:9.133(SCI一区)研究背景最近几年,对肠道微生物群(GM)的研究已经不仅仅是描述分类组成,通常是将16S rRNA基因测序应用于粪便样本,更广泛地研究GM的功能潜力,这是通过鸟枪法宏基因组学(MG)方法实现的。群体MG研究表明,尽管存在较大的个体间结构/组成变异,GMs仍有一组稳定的核心功能。然而,由于测序的基因不一定表达,MG不能提供可靠的信息,说明哪些微生物的功能特征实际上在响应宿主代谢、免疫、神经生物学、饮食或其他环境因素的刺激而发生变化。相反,这类信息可以由功能宏组学收集,如宏转录组学(MT)和宏蛋白质组学(MP),它们对微扰具有较高的敏感性,因此可能更好地反映宿主微生物相互作用。在这方面,特别令人感兴趣的是调查人类群体中潜在的和实际活跃的GM特征之间的关系,为了从已知的MG的潜能开始鉴定在健康肠中组成型表达的微生物功能。最近的一项研究已经针对MT实现了这一目标,在具有最高表达率(mRNA/DNA比率)和参与淀粉代谢,氨基酸生物合成,孢子形成和以及具有最低表达率的肽聚糖生物合成的基因中发现了核糖体蛋白和柠檬酸循环酶的转录物。人们对微生物蛋白的了解较少,尽管它们提供了有关GM代谢的主要信息,并且代表了宿主-GM相互作用中的关键分子。尽管有一些开创性的研究提出了对疾病有关的人类群体中的宏基因组和宏蛋白组的分析,到目前为止,还没有系统地、比较地调查健康人群的分类学和功能特征,这种特征可能和实际由GM表达。材料与方法01实验设计图1本研究的实验设计注:从临床监测的撒丁岛人群中选出15名健康成人(男性7名,女性8名)。从每个人身上采集粪便样本,同时进行Illumina鸟枪法DNA测序(宏基因组)和LTQ-Orbitrap鸟枪法质谱分析(宏蛋白组)。宏基因组学也被用作序列数据库,以便进行严格的宏蛋白质组/宏基因组比较,并进行分类和功...
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    发布时间: 2018 - 11 - 26
    摘要全转录组范围内鉴定能与蛋白结合的RNA(RBPs),是了解转录后基因调控网络的必要条件。然而RBPs蛋白组的研究主要局限于多聚腺苷酸的RNA与蛋白的结合,对于没有ploy-A尾的RNA(主要的是非编码RNA和RNA前体)几乎都没发现。本文介绍了一种点击化学(主旨是通过小单元的拼接,来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。它尤其强调开辟以碳-杂原子键(C-X-C)合成为基础的组合化学新方法,并借助这些反应(点击反应)来简单高效地获得分子多样性。)辅助的RNA互作捕获策略(CARIC),能够对RBPs进行无差别鉴定,不受RNA是否具有ploy-A尾的约束。CARIC主要是利用炔基尿苷类似物对RNA进行标记,并在活体内进行RNA-protein光照交联,然后与叠氮化物生物素进行点击化学反应,亲和富集后进行蛋白组分析。利用CARIC在人的宫颈癌细胞中鉴定到597个RBPs,包括130个之前未知的RBPs。这些新发现的RBPs可能是和非编码RNA结合的,因此发现了一些之前未知的非编码RNA参与的过程(例如蛋白酶体功能和中间代谢)。材料方法实验材料:人的宫颈癌细胞,胚肾细胞;质粒构建和细胞转染:克隆宫颈癌细胞cDNA(hnRNPC,MBNL1,VDAC1,NME2),克隆质粒:VigoFect;几种已知RPBs用来验证CARIC技术成功率CARIC分离出的RNA测序:Illumina HisEq 4000 PE150;蛋白质谱检测:LC-MS/MS,Easy nLC 1000 system +Velos Pro Orbitrap Elite mass spectrometer;质谱数据分析:MaxQuant version 1.5.5.1(原始数据分析),依靠人的蛋白数据(UniProt)Andromeda search engine进行蛋白查询;CARIC RBPs验证:CLIP...
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    发布时间: 2018 - 11 - 09
    前沿慢性阻塞性肺病(COPD)是一种炎性疾病,其特征在于进行性空气流量限制,并且被认为部分地由于响应于慢性空气污染物暴露(主要来自吸烟)而引起的夸大的肺部炎症。目前可用的治疗方法在很大程度上是无效的。因此,有效治疗COPD迫切需要新型的治疗药物。前期系统药理学鉴定了补肺益肾方(BYF)的195种潜在靶点,并被证实对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠有短期治疗作用。然而,对慢性阻塞性肺疾病(COPD)的长期疗效及机制尚不清楚。因此,本研究以慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠为研究对象,于第9~20周给药。然后通过转录组学-蛋白质组学-代谢组学分析第32周BYF对慢性阻塞性肺病大鼠的长期影响。材料与方法样本收集第0-8周构建COPD大鼠模型,将32只大鼠置于一个暴露于烟草和反复肺炎克雷伯菌感染的封闭的盒子里,第9-20周大鼠每日灌胃给予生理盐水(2mL)、BYF(4.44g/kg,0.5g/ml)和氨茶碱(2.3mg/kg)。检测方法转录组:Microarray(4×44K)大鼠全基因组表达谱芯片;蛋白组:8-plex iTRAQ,NanoLC-QTOF-MS;代谢组:Agilent-1200 LC-Agilent-6520 Q-TOF;数据分析Agilent GeneSpring GX software version 11.0Mascot:蛋白质鉴定Mass Hunter:代谢物鉴定SIMCA-P:PLS-DA基因、蛋白质和代谢物集富集、网络和通路分析Bingo(CytosCapev3.1.1插件)用于分析转录本和蛋白质的分子功能;DAVID和KEGG数据库对转录本和蛋白质进行途径富集分析。Metscape用于分析基因、蛋白质和代谢组学数据的整合途径;ClueGO(Cytoscape插件被用来探索基因和蛋白的分子功能。MetaboAnalyst 3.0被用来确定代谢物...
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    发布时间: 2018 - 11 - 08
    砷暴露对小鼠肠道宏基因组和代谢谱的响应IF=8.3091.摘要背景:人类肠道是一个极其复杂、多样和庞大的微生物群落-肠道微生物群。肠道微生物群在代谢过程、能量产生、免疫和认知发育、上皮稳态等方面发挥着重要作用。然而,肠道微生物群的组成和多样性很容易受到外界因素的影响,这就增加了接触有毒环境化学物质导致肠道微生物群改变或失调的可能性。砷的暴露影响全世界的大量人口,并且与许多疾病有关,包括癌症,糖尿病和心血管疾病。目的:研究了砷暴露对肠道微生物组成及其代谢状况的影响。方法:采用16S rRNA基因测序和质谱代谢组学分析相结合的方法,研究砷暴露对肠道微生物群的功能影响。结果:16S rRNA基因测序结果表明,10 ppm砷暴露4周后,砷对C57BL/6小鼠肠道微生物组分有明显的干扰作用。此外,代谢组学图谱显示了一种并行效应,许多肠道菌群相关的代谢物在多个生物基质中被干扰。结论:砷的暴露不仅改变肠道微生物群落的丰度水平,而且在功能水平上也严重干扰其代谢状况。这些发现可能为肠道微生物群的微扰及其作为接触砷导致或加重人类疾病的潜在新机制的作用提供新的见解。2.材料和方法动物和处理:无特定病原体的C57BL/6雌性小鼠20只(6周龄,体重20±3g)。平均分为两组。两组小鼠在同样的环境条件下饲养,供给相同的食物和水。饲养到8周龄后,处理组:饮用水中注入无机砷(亚砷酸钠,10ppm)持续四周;对照组:依旧供给清水。在整个实验过程中,每天评估小鼠腹泻,脱水和身体状况恶化的情况。用砷4周后,用二氧化碳对小鼠实施安乐死并进行尸体剖检。对肝脏(左侧,内侧,右侧和尾状叶)和结肠(远端,横向和前期结肠)的多发区域的炎症,水肿,上皮缺损,高血浆和发育异常等指标进行评估。病理评分未显示对照组和砷治疗组小鼠之间存在任何显着差异,也未观察到体重,死亡率和食物摄入量的任何显着变化。16SrRNA测序数...
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    发布时间: 2018 - 10 - 30
    文章题目:A strategy for association study on intestinal microbiomeand brain metabolome across lifespan of rats.杂志:Analytical  Chemistry 影响因子:IF=6.0421摘要   人们越来越认识到微生物群-肠-脑轴在哺乳动物一生中对哺乳动物生长和健康的不同作用。大量研究表明,肠道微生物群及其代谢物广泛参与脑与肠的沟通。脑代谢组与肠道微生物的关联研究是一个活跃的领域,它提供了大量关于微生物、脑和肠道相互作用的信息,但数据大小和复杂的层次关系是形成重要的、可重复的结论的主要障碍。本研究采用多种分析平台和生物信息学方法,对雄性Wistar大鼠在生长过程中的脑代谢和肠道微生物群关联分析进行了两级策略的研究。轨迹分析表明,与年龄相关的脑代谢组和肠道微生物在总体变化模式上具有相似性。 四个高水平分类的相关对“代谢类型—细菌门”包含“脂质-螺旋菌”、“游离脂肪酸-厚壁菌门”、“胆汁酸-厚壁菌门”、“神经递质-拟杆菌门”在单元-多元相关分析和功能分析的基础上被筛选出。进一步鉴定了上述高水平关键对中的四组特异性“代谢产物-细菌”关联对。通过一项独立的动物研究验证了关键相关对的有效性。这种两级策略有效地识别了从系统多组学研究中获得的大数据集中的主要相关性,加深我们对大脑和肠道之间终生联系的理解。材料与方法动物材料:正常生长实验取出生后第1、3、7、12、24、56、111周的雄性大鼠全脑和肠内容物,每组6只,共42只。      在限制饮食验证实验中,12只雄性大鼠(4周龄)被喂食3周,然后6只(随机选择)饲喂Libitum,其余6只饲喂60%的Libitum 5周...
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通过RNA-seq鉴定和分析野生大豆(Glycine soja)根中的NaHCO3胁迫应答基因

日期: 2018-04-26
浏览次数: 90

文章标题:Identification and Analysis of NaHCO3 Stress Responsive Genes in Wild Soybean (Glycine soja) Roots by RNA-seq.

期刊:Frontiers in Plant Science.

影响因子:IF=4.495.

发表时间:2016年11月.

作者单位:National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, National Center for Soybean Improvement, Key Laboratory for Biology and Genetic Improvement of Soybean (General, Ministry of Agriculture), Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production, Nanjing Agricultural University, China.

 

摘要:

土壤碱度是作物生产力和质量的主要非生物限制因素。野生大豆(Glycine soja)被认为比栽培大豆(G.max)更具胁迫耐受性,并且对于增加大豆的碱性耐受性有相当大的遗传变异。在这项研究中,通过RNA测序,分析了碱性耐受的野生大豆品种N2485290mM NaHCO3胁迫12小时和24小时的根的转录组。与对照相比,在NaHCO3处理12小时和24小时后,共鉴定了449个差异表达基因(DEGs),包括95个和140个上调基因,108个和135个下调基因。14个DEGs的定量RT-PCR分析显示与RNA测序结果的高一致性。与转录因子和转运蛋白相关的GO富集分析显示,在NaHCO3胁迫后12小时和24小时显著富集上调基因。核因子Y亚基ANF-YA)转录因子在NaHCO3应激后12小时富集,碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)、乙烯反应因子(ERF)、三螺旋和锌指(C2H2、C3H)转录因子在NaHCO3应激后12和24小时发现。与ABC转运蛋白、铝激活的苹果酸转运蛋白(ALMT)、谷氨酸受体(GLR)、硝酸盐转运蛋白(NRT/质子依赖性寡肽(POT)家族、S型阴离子通道(SLAH)等离子转运蛋白相关的基因在NaHCO3处理后24小时富集上调基因,这意味着它们在碱性条件下维持大豆根中的离子稳态。KEGG通路富集分析显示“苯丙素类生物合成”和“苯丙氨酸代谢”途径可能参与大豆对碱胁迫的应答。这项研究为进一步调查碳酸氢盐胁迫应答基因的功能和大豆耐碱性的分子基础提供了根据。

 

材料与方法:

材料野生大豆(Glycine soja

取材方法对129个大豆品种初步筛选,鉴定出耐碱性野生大豆品种N24852。大豆种子用1%次氯酸钠表面灭菌30秒,并用去离子水冲洗三次。将二十粒种子播种在装有干净石英砂的塑料盆中。发芽后7天,将幼苗稀释至每盆四株植物。将四个罐放置在含有1.5L新鲜1/2浓度的Hoagland营养液(pH6.5)的塑料容器中,其可通过底部的小孔吸收营养液。当出现第二个三小叶(种植后约14天)时,施加包含90mM NaHCO3(最终pH为8.5,通过加入KOH调节)的处理溶液以诱导碱性胁迫。对照不含NaHCO3。实验设置三个生物学重复。处理12和24小时后,收集根尖(3cm),液氮中冷冻并储存在-80℃用于提取RNA。剩余的根组织和叶,用于测量离子浓度。

 

测序策略和分析流程:

测序:Illumina HiSeq2500。共12个样本。原始reads共283.6M。clean reads共270.5M。

分析:比对到大豆参考基因组:Tophat2 (v2.0.13);

      基因表达水平标准化为FPKM:Cufflinks v2.2.2

      DEGs鉴定:R package DESeq

  基因功能注释数据库:Nr (NCBI non-redundant protein sequences);Pfam (Protein family)KOG/COG (Clusters of Orthologous Groups of proteins)Swiss-Prot (A manually annotated and reviewed protein sequence database)KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)GO (Gene Ontology)

      功能注释软件:BLASTn (v 2.2.26) software;hmmscan (v 3.0) software

  

 

结果:

1、 野生大豆N24852对NaHCO3胁迫的表型和生理反应

N24852和Lee68在对照(CK)和碱性胁迫下的离子浓度和比率。

根中(A)Na+浓度,(B)Na+/ K+比率,(C)Na+/ Ca2+比率。

叶中(D)Na+浓度,(E)Na+/ K+比率,(F)Na+/ Ca2+比率。

低Na+浓度的维持和Na+/ K+和Na+/ Ca2+的低比率被广泛用作植物耐盐性的指数。为了评价野生大豆N24852的碱度耐受性,使用耐盐大豆品种Lee 68用于比较。野生大豆N24852NaHCO3胁迫表现出比Lee 68更大的耐受性。在NaHCO3处理后,两种大豆品种根中Na+的浓度,Na+/ K+和Na+/ Ca2+的比例增加,但野生大豆N24852根中Na+浓度、Na+/ K+和Na+/ Ca2+的比例显著低于Lee 68。N24852叶片中Na+浓度,Na+/ K+和Na+/ Ca2+的比例也低于Lee68。

通过RNA-seq鉴定和分析野生大豆(Glycine soja)根中的NaHCO3胁迫应答基因 

 

2、 NaHCO3胁迫下大豆根中差异表达基因(DEGs)的鉴定

碱性胁迫和对照之间差异表达的基因(DEG)的维恩图。

A12h:12h的碱性胁迫;A24h24h的碱性胁迫。

与对照相比,NaHCO3胁迫下野生大豆根中总共有449个基因差异表达。在碱性胁迫12小时和24小时后,分别有95个和140个上调的基因、108个和135个下调的基因,在24小时碱性胁迫后检测到更多的DEGs,意味着24h后发生更多的转录变化。

通过RNA-seq鉴定和分析野生大豆(Glycine soja)根中的NaHCO3胁迫应答基因 

 

 

3、 在两个时间点(12h和24h)均存在的差异表达基因(DEGs)的热图

在两个时间点,9个基因上调,20个基因下调,表明它们在大豆对NaHCO3应激反应中的重要性。重叠的上调基因包括两个铝激活苹果酸转运蛋白(ALMT)基因和一个编码胚胎后期富集蛋白(LEA)的基因。已报道ALMT转运蛋白在植物对非生物胁迫的适应中起作用,而LEA蛋白的积累是响应由干旱、高温、盐度引起的水分亏缺。

通过RNA-seq鉴定和分析野生大豆(Glycine soja)根中的NaHCO3胁迫应答基因 

 

 

4、 DEGs功能分类和GO富集分析

NaHCO3胁迫12小时(A)和24小时(B)的上调基因的GO富集分析。带有IDGO号写在框中。彩框差异显著,白框不显著。

在12小时的碱性胁迫下,具有转录因子活性的基因显著富集。

在24小时的碱性胁迫下,具有转运蛋白活性、碳水化合物结合的分子功能、参与生物过程转运的基因显著富集。

通过RNA-seq鉴定和分析野生大豆(Glycine soja)根中的NaHCO3胁迫应答基因 

 

 

5、 基因表达水平的RNA-seq和qRT-PCR结果比较分析

(A)90mM NaHCO3胁迫后12h的14个基因(四个POD-过氧化物酶编码基因,三个在两时间点均上调的基因,两个在两时间段均下调的基因,五个仅在一个时间点上调或下调的基因)的log2倍数变化;

(B)90mM NaHCO3胁迫后24h的14个基因的log2倍数变化;

(C)RNA-seqx轴)和qRT-PCRy轴)获得的log2倍数变化的比较,显示高度一致性。

通过RNA-seq鉴定和分析野生大豆(Glycine soja)根中的NaHCO3胁迫应答基因 

 

 

6、 转录因子相关的DEGs

12h(A)和24hB)的NaHCO3处理的差异表达基因(DEG)的转录因子家族。共130173个转录因子(TF)分别在NaHCO3胁迫后12h和24h差异表达。在差异表达的转录因子中,在两个时间点都发现碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)、乙烯反应因子(ERF)、三螺旋和锌指(C2H2、C3H)家族。核因子Y亚基ANF-YA)家族在NaHCO3应激后12小时富集。这些转录因子已经被报道在植物对非生物胁迫的应答中起作用。

通过RNA-seq鉴定和分析野生大豆(Glycine soja)根中的NaHCO3胁迫应答基因 

 

 

7、 转运相关的DEGs

已报道ABC转运蛋白、ALMT家族、谷氨酸受体(GLR)、硝酸盐转运蛋白(NRT/质子依赖性寡肽(POT)家族和S-型阴离子通道(SLAH)在离子转运中起作用,保持植物对NaHCO3胁迫的响应中的离子稳态。9个转运蛋白基因在NaHCO3胁迫后12小时差异表达(表1)。在NaHCO3胁迫后24小时,富集转运相关基因。24个转运基因上调,3个转运基因下调,包括编码ABC转运蛋白、ALMT、铵转运蛋白、水通道蛋白转运蛋白、阳离子外排子家族、GLRNRT/ POT家族、SLAH、硫酸转运蛋白和锌/铁转运蛋白。研究结果表明这些转运基因在维持大豆对NaHCO3应激反应的稳态离子的重要性。

通过RNA-seq鉴定和分析野生大豆(Glycine soja)根中的NaHCO3胁迫应答基因 

 

亮点分析:

1、在本研究中,鉴定了耐碱性野生大豆品种N24852,其在NaHCO3胁迫下在叶和根中显示低的Na+浓度。

2、这项研究提供了一系列的NaHCO3应激反应基因,以帮助进一步了解植物对碱性胁迫的反应。


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