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    发布时间: 2018 - 12 - 10
    英文标题:Selection and Validation of Novel RT-qPCR Reference Genes under Hormonal Stimuli and in Diferent Tissues of Santalum album杂志:Scientific  Reports影响因子:IF=4.122摘要   逆转录实时定量聚合酶链式反应 (RT-qPCR)因其高通量、特异性和敏感性而被广泛应用于基因表达水平的研究。为了获得准确可靠的结果,RT-qPCR分析必须有一个合适的参考基因。到目前为止,经济热带树种檀香((Santalum album L.)还没有被验证的可靠参考基因。在本研究中,有13个候选参考基因(包括从大量的檀香转录组数据中筛选出的12个新的可能的参考基因,以及目前使用的β-actin基因)在不同的组织(茎、叶、根和愈伤组织)、以及水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯 (MeJA)、赤霉素(GA)处理作用下的愈伤组织中,用GeNorm,NormFinder,BestKeeper,Delta CT和 RefFinder算法综合验证。几种新的候选参考基因比目前使用的传统基因ACT要稳定得多。SA处理中ODD和Fbp1、MeJA处理中的CSA 和Fbp3、JA处理中的PP2C和Fbp2、以及3个激素处理中FBP 1和FBP 2,分别是最准确的参考基因。当FAB1A与PP2C结合后,被鉴定为四种组织最适宜的参考基因组合。而HLMt, PPR和FAB1A的组合则是所有实验样本中最理想的参考基因。此外,为了验证我们的结果,我们还通过参考基因及他们的组合在MeJA处理下的三种檀香组织中评估了SaSSy基因的相对表达水平。本研究中所鉴定的参考基因将提高RT-qPCR分析的准确性,并将有...
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    发布时间: 2018 - 12 - 03
    发表期刊:Microbiome影响因子:9.133(SCI一区)研究背景最近几年,对肠道微生物群(GM)的研究已经不仅仅是描述分类组成,通常是将16S rRNA基因测序应用于粪便样本,更广泛地研究GM的功能潜力,这是通过鸟枪法宏基因组学(MG)方法实现的。群体MG研究表明,尽管存在较大的个体间结构/组成变异,GMs仍有一组稳定的核心功能。然而,由于测序的基因不一定表达,MG不能提供可靠的信息,说明哪些微生物的功能特征实际上在响应宿主代谢、免疫、神经生物学、饮食或其他环境因素的刺激而发生变化。相反,这类信息可以由功能宏组学收集,如宏转录组学(MT)和宏蛋白质组学(MP),它们对微扰具有较高的敏感性,因此可能更好地反映宿主微生物相互作用。在这方面,特别令人感兴趣的是调查人类群体中潜在的和实际活跃的GM特征之间的关系,为了从已知的MG的潜能开始鉴定在健康肠中组成型表达的微生物功能。最近的一项研究已经针对MT实现了这一目标,在具有最高表达率(mRNA/DNA比率)和参与淀粉代谢,氨基酸生物合成,孢子形成和以及具有最低表达率的肽聚糖生物合成的基因中发现了核糖体蛋白和柠檬酸循环酶的转录物。人们对微生物蛋白的了解较少,尽管它们提供了有关GM代谢的主要信息,并且代表了宿主-GM相互作用中的关键分子。尽管有一些开创性的研究提出了对疾病有关的人类群体中的宏基因组和宏蛋白组的分析,到目前为止,还没有系统地、比较地调查健康人群的分类学和功能特征,这种特征可能和实际由GM表达。材料与方法01实验设计图1本研究的实验设计注:从临床监测的撒丁岛人群中选出15名健康成人(男性7名,女性8名)。从每个人身上采集粪便样本,同时进行Illumina鸟枪法DNA测序(宏基因组)和LTQ-Orbitrap鸟枪法质谱分析(宏蛋白组)。宏基因组学也被用作序列数据库,以便进行严格的宏蛋白质组/宏基因组比较,并进行分类和功...
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    发布时间: 2018 - 11 - 26
    摘要全转录组范围内鉴定能与蛋白结合的RNA(RBPs),是了解转录后基因调控网络的必要条件。然而RBPs蛋白组的研究主要局限于多聚腺苷酸的RNA与蛋白的结合,对于没有ploy-A尾的RNA(主要的是非编码RNA和RNA前体)几乎都没发现。本文介绍了一种点击化学(主旨是通过小单元的拼接,来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。它尤其强调开辟以碳-杂原子键(C-X-C)合成为基础的组合化学新方法,并借助这些反应(点击反应)来简单高效地获得分子多样性。)辅助的RNA互作捕获策略(CARIC),能够对RBPs进行无差别鉴定,不受RNA是否具有ploy-A尾的约束。CARIC主要是利用炔基尿苷类似物对RNA进行标记,并在活体内进行RNA-protein光照交联,然后与叠氮化物生物素进行点击化学反应,亲和富集后进行蛋白组分析。利用CARIC在人的宫颈癌细胞中鉴定到597个RBPs,包括130个之前未知的RBPs。这些新发现的RBPs可能是和非编码RNA结合的,因此发现了一些之前未知的非编码RNA参与的过程(例如蛋白酶体功能和中间代谢)。材料方法实验材料:人的宫颈癌细胞,胚肾细胞;质粒构建和细胞转染:克隆宫颈癌细胞cDNA(hnRNPC,MBNL1,VDAC1,NME2),克隆质粒:VigoFect;几种已知RPBs用来验证CARIC技术成功率CARIC分离出的RNA测序:Illumina HisEq 4000 PE150;蛋白质谱检测:LC-MS/MS,Easy nLC 1000 system +Velos Pro Orbitrap Elite mass spectrometer;质谱数据分析:MaxQuant version 1.5.5.1(原始数据分析),依靠人的蛋白数据(UniProt)Andromeda search engine进行蛋白查询;CARIC RBPs验证:CLIP...
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    发布时间: 2018 - 11 - 09
    前沿慢性阻塞性肺病(COPD)是一种炎性疾病,其特征在于进行性空气流量限制,并且被认为部分地由于响应于慢性空气污染物暴露(主要来自吸烟)而引起的夸大的肺部炎症。目前可用的治疗方法在很大程度上是无效的。因此,有效治疗COPD迫切需要新型的治疗药物。前期系统药理学鉴定了补肺益肾方(BYF)的195种潜在靶点,并被证实对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠有短期治疗作用。然而,对慢性阻塞性肺疾病(COPD)的长期疗效及机制尚不清楚。因此,本研究以慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠为研究对象,于第9~20周给药。然后通过转录组学-蛋白质组学-代谢组学分析第32周BYF对慢性阻塞性肺病大鼠的长期影响。材料与方法样本收集第0-8周构建COPD大鼠模型,将32只大鼠置于一个暴露于烟草和反复肺炎克雷伯菌感染的封闭的盒子里,第9-20周大鼠每日灌胃给予生理盐水(2mL)、BYF(4.44g/kg,0.5g/ml)和氨茶碱(2.3mg/kg)。检测方法转录组:Microarray(4×44K)大鼠全基因组表达谱芯片;蛋白组:8-plex iTRAQ,NanoLC-QTOF-MS;代谢组:Agilent-1200 LC-Agilent-6520 Q-TOF;数据分析Agilent GeneSpring GX software version 11.0Mascot:蛋白质鉴定Mass Hunter:代谢物鉴定SIMCA-P:PLS-DA基因、蛋白质和代谢物集富集、网络和通路分析Bingo(CytosCapev3.1.1插件)用于分析转录本和蛋白质的分子功能;DAVID和KEGG数据库对转录本和蛋白质进行途径富集分析。Metscape用于分析基因、蛋白质和代谢组学数据的整合途径;ClueGO(Cytoscape插件被用来探索基因和蛋白的分子功能。MetaboAnalyst 3.0被用来确定代谢物...
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    发布时间: 2018 - 11 - 08
    砷暴露对小鼠肠道宏基因组和代谢谱的响应IF=8.3091.摘要背景:人类肠道是一个极其复杂、多样和庞大的微生物群落-肠道微生物群。肠道微生物群在代谢过程、能量产生、免疫和认知发育、上皮稳态等方面发挥着重要作用。然而,肠道微生物群的组成和多样性很容易受到外界因素的影响,这就增加了接触有毒环境化学物质导致肠道微生物群改变或失调的可能性。砷的暴露影响全世界的大量人口,并且与许多疾病有关,包括癌症,糖尿病和心血管疾病。目的:研究了砷暴露对肠道微生物组成及其代谢状况的影响。方法:采用16S rRNA基因测序和质谱代谢组学分析相结合的方法,研究砷暴露对肠道微生物群的功能影响。结果:16S rRNA基因测序结果表明,10 ppm砷暴露4周后,砷对C57BL/6小鼠肠道微生物组分有明显的干扰作用。此外,代谢组学图谱显示了一种并行效应,许多肠道菌群相关的代谢物在多个生物基质中被干扰。结论:砷的暴露不仅改变肠道微生物群落的丰度水平,而且在功能水平上也严重干扰其代谢状况。这些发现可能为肠道微生物群的微扰及其作为接触砷导致或加重人类疾病的潜在新机制的作用提供新的见解。2.材料和方法动物和处理:无特定病原体的C57BL/6雌性小鼠20只(6周龄,体重20±3g)。平均分为两组。两组小鼠在同样的环境条件下饲养,供给相同的食物和水。饲养到8周龄后,处理组:饮用水中注入无机砷(亚砷酸钠,10ppm)持续四周;对照组:依旧供给清水。在整个实验过程中,每天评估小鼠腹泻,脱水和身体状况恶化的情况。用砷4周后,用二氧化碳对小鼠实施安乐死并进行尸体剖检。对肝脏(左侧,内侧,右侧和尾状叶)和结肠(远端,横向和前期结肠)的多发区域的炎症,水肿,上皮缺损,高血浆和发育异常等指标进行评估。病理评分未显示对照组和砷治疗组小鼠之间存在任何显着差异,也未观察到体重,死亡率和食物摄入量的任何显着变化。16SrRNA测序数...
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    发布时间: 2018 - 10 - 30
    文章题目:A strategy for association study on intestinal microbiomeand brain metabolome across lifespan of rats.杂志:Analytical  Chemistry 影响因子:IF=6.0421摘要   人们越来越认识到微生物群-肠-脑轴在哺乳动物一生中对哺乳动物生长和健康的不同作用。大量研究表明,肠道微生物群及其代谢物广泛参与脑与肠的沟通。脑代谢组与肠道微生物的关联研究是一个活跃的领域,它提供了大量关于微生物、脑和肠道相互作用的信息,但数据大小和复杂的层次关系是形成重要的、可重复的结论的主要障碍。本研究采用多种分析平台和生物信息学方法,对雄性Wistar大鼠在生长过程中的脑代谢和肠道微生物群关联分析进行了两级策略的研究。轨迹分析表明,与年龄相关的脑代谢组和肠道微生物在总体变化模式上具有相似性。 四个高水平分类的相关对“代谢类型—细菌门”包含“脂质-螺旋菌”、“游离脂肪酸-厚壁菌门”、“胆汁酸-厚壁菌门”、“神经递质-拟杆菌门”在单元-多元相关分析和功能分析的基础上被筛选出。进一步鉴定了上述高水平关键对中的四组特异性“代谢产物-细菌”关联对。通过一项独立的动物研究验证了关键相关对的有效性。这种两级策略有效地识别了从系统多组学研究中获得的大数据集中的主要相关性,加深我们对大脑和肠道之间终生联系的理解。材料与方法动物材料:正常生长实验取出生后第1、3、7、12、24、56、111周的雄性大鼠全脑和肠内容物,每组6只,共42只。      在限制饮食验证实验中,12只雄性大鼠(4周龄)被喂食3周,然后6只(随机选择)饲喂Libitum,其余6只饲喂60%的Libitum 5周...
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与小麦抗白粉病基因 Pm48 紧密连锁分子标记的开发

日期: 2016-03-24
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 Pm48 为本实验室鉴定的一个抗白粉病新基因。为精细定位该基因,利用混池 ddRAD 测序鉴定了 81 个与该基因关联的序列,开发了 STS 标记 Xmp931,转化了 CAPS 标记 Xmp928Xmp930 和 Xmp936;同时,利用粗山羊草基因组序列开发了 71 个基因组 SSR 标记, 定位了其中的 Xmp1089 和 Xmp1112。 在 115 个宁糯麦 ´Tabasco 衍生的 F2:3 家系中, Xmp928
与目的基因共分离,Xmp1112 位于近着丝粒方向处距抗病基因 3.1 cM。在 671 个纯合感病家系中,标记 Xmp928 仍与目的基因共分离。利用 个中国春 5DS 缺失系,最终将 Pm48 定位在小麦 5DS 上 0.63–0.67 的臂区段中。
关键词:小麦;抗白粉病基因;分子标记;混池 ddRAD 测序 

 

1 材料与方法

1.1 试验材料

利用抗小麦白粉病的德国品种 Tabasco 与本实验室培育的糯性感病品种糯麦 1 号,经杂交和自交获得 4129 个宁糯麦 1号×Tabasco F2 单株,用于抗性遗传分析;从 436 个 F2:3 家系[19]中随机选择 115 个家系组成分离群体用于新开发分子标记的多态性分析和定位。

利用“中国春”及其缺失系 del5DS-1、 del5DS-2 和 del5DS-5 进行目标分子标记的染色体臂定位, 其中 del5DS-1 保留有 5DS末端 63%长度,缺失了 37%的染色体长度,del5DS-5 保留有染色体 5DS 末端 67%长度,缺失了 33%的染色体长度, del5DS-2保留有 5DS 末端 78%长度,缺失了 22%的染色体长度[21]。

 

1.2 抗病性评价方法

参考高海东等[19]报道的方法评价白粉病抗性。将小麦种子播在 72 孔的穴盘,亲本品种及家系各播种 15~20 粒,每穴盘随机种植 9 粒感病对照苏麦 3 号。于幼苗一叶期人工接菌孢子,菌种为南京地区流行的 Bgt18。在人工智能气候室(14 h 光照/10 h 黑暗, 18~22℃, 相对湿度 80%~90%)中培养接种后的麦苗。接种后 7 d 天当感病对照表现出明显病症时调查病情,按盛宝钦[22]的 0~4 级分类方法记录,即 0 级为免疫,植株无病斑,0;级为坏死反应,叶片有枯死斑,1 级为高抗,病斑直径小于 l mm,菌丝层稀薄可见绿色叶面,偶见较大病斑,但仍透绿,产孢量极少,2 级为中抗,叶片病斑直径小于 l mm,但菌丝层较厚,不透绿,能产生一定量孢子,3 级为中感,叶片病斑多,且直径大于 l mm,菌丝层厚,产孢量大,但病斑不连片,4 级为高感,叶片病斑直径大于 l mm,菌丝层厚,产孢量多,病斑连片。

 

1.3 分子标记开发

1.3.1 基于 ddRAD 测序获得的序列

根据前期 F2:3 家系的分子鉴定结果[19],从中随机选取 50 个纯合抗病家系和 50 个纯合感病家系,每家系选取 8 株, 将其 DNA 等量混合构建抗池(BR)和感池(BS),由南京集思慧远生物科技有限公司进行 ddRAD测序。根据抗感池序列 SNP 是否产生酶切位点差异,决定转化成 CAPS 或 dCAPS 标记。如果抗、感池间的 SNP 存在酶切位点的差异,则直接将该 SNP 标记转化成 CAPS 标记,即在 SNP 位点两侧设计引物,并利用相应的限制性内切酶进行酶切;如果抗、 感池间的 SNP 不存在酶切位点的差异, 则利用软件 dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)和 Primer5.0 将 SNP 转化成 dCAPS 标记,即在引物中引入错配与 SNP 位点形成新的酶切位点。新开发的多态标记信息见表1。

 

1.3.2 基于粗山羊草基因组序列

高海东等[19]鉴定出 Pm48 的紧密连锁标记 Xmp510。本研究利用 Xmp510 序列及 ddRAD测序获得的多态标记序列,在线搜索比对粗山羊草标记序列(http://probes.pw.usda.gov/WheatDMarker/phpblast/blast.php)。先对相应的粗山羊草基因组序列进行 SSR 筛查,然后用 MACVECTOR V8.0(Accelrys, UK)设计引物,并进行亲本及抗感池间多态性筛选。新开发的多态标记信息见表 1。

与小麦抗白粉病基因 Pm48 紧密连锁分子标记的开发 

 

1.4 分子标记分析

参照 Ma 等[23]报道的 SDS 法,从小麦嫩叶中提取总 DNA,–4℃保存。在 SENSOQUEST LABCYCLER PCR 仪(德国)上扩增,反应体系为 10 µL,包括 1× buffer 10µL (含 MgCl2 15 nmol),DNA 模板 1 ng,左、右引物各 2 pmol,2 nmol 的 dNTPs,1 U Taq 酶。PCR 程序为 94℃预变性 5 min,然后按 94℃变性 30 s、50~60℃退火 45 s、72℃延伸 50 s 进行 36 个循环扩增,最后 72℃延伸 7 min。扩增产物经 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染法显色。

CAPS 标记选择特定的限制性内切酶(TaKaRa),如 Alu I、Acc I、Mae II、Hpy 188I 和 Taq I,按生产商说明书进行酶切反应,反应体系 8 µL,含 PCR 产物约 50 ng,于 37°C 或 65°C (依酶特性而定)过夜,用 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测酶切产物。

 

1.5 遗传图谱构建

采用 Mapmaker 3.0b/EXP[24]和 MapDrawV2.1[25]构建连锁图谱,选用 Kosambi 函数[26]计算遗传距离,连锁判断 LOD 阈值设为 3.0。

 

2 结果与分析

2.1 与 Pm48 连锁分子标记的开发及定位

对抗池、感池进行 ddRAD 测序,获得 81 个可能与 Pm48 关联的 SNP 序列,将其中 14 个关联性强的 SNP 标记转化为STS 或者 CAPS 标记。其中,Xmp931 在抗、感亲本间有多态性,且与抗、感池表现一致;Xmp928 (图 1-A)、Xmp930 (图 1-B)和 Xmp936 经相应的限制性内切酶酶切后,在抗、感亲本以及池间表现一致多态性。利用这 4 个新开发的标记检测 115 个F2:3 家系,结果 4 个标记均被定位于 Pm48 的遗传图谱上,其中 Xmp928 与目标基因共分离,Xmp931、Xmp936 和 Xmp930位于远着丝粒的一侧,与目标基因分别相距 7.8、9.7 和 15.7 cM (图 2-A)。

与小麦抗白粉病基因 Pm48 紧密连锁分子标记的开发 

利用已定位 Pm48 连锁标记序列信息,比对粗山羊草基因组序列,开发了 71 个 gSSR 标记,其中 Xmp1089 (图 1-C)和Xmp1112 (图 3)在抗、感基因型间存在多态性,并且被整合到 Pm48 连锁图谱中,距 Pm48 分别为 3.1 cM 和 10.8 cM (图 2-A)。

与小麦抗白粉病基因 Pm48 紧密连锁分子标记的开发 

 

2.2 Pm48 的染色体臂定位

利用 3 个中国春 5DS 缺失系对 Pm48 进行染色体臂定位,结果显示 Xmp1112 位于小麦 5DS 0.63~0.67 的染色体区段(图3),在该染色体区段中已定位标记 Xcfd81 [19],同时连锁图谱显示 Pm48 位于这两个标记之间(图 2-A),因此认为 Pm48 位于小麦 5DS 0.63~0.67 的染色体区段(图 2-B)。

与小麦抗白粉病基因 Pm48 紧密连锁分子标记的开发 

 

2.3 重组体的筛选

利用 4129 个 F2 单株,通过接种 Bgt18 鉴定抗病性,结果有 3103 个抗病单株和 1026 个感病单株,符合单个显性基因的3:1 分离(c2=0.04;c20.05,1=3.84)。这些感病单株移栽后完成整个生育期并收获种子的有 671 个家系,对每个家系衍生的 15~20个植株进行表型鉴定后, 推测均为纯合感病家系。 利用位于 Pm48 两侧的分子标记对这 671 个纯合感病家系进行基因型检测,其中共显性标记 Xmp1112 和 Xcfd81 分别筛选到 12 个和 8 个重组家系;标记 Xmp928 和 Xmp510 对这 19 个重组体进行基因型的分析结果表明,Xmp510 检测到 5 个重组体,Xmp928 没有检测到重组体,与目标基因共分离(表 2)。

与小麦抗白粉病基因 Pm48 紧密连锁分子标记的开发 

 

3 讨论

为进一步精细定位小麦抗白粉病基因 Pm48,本研究利用简化测序和粗山羊草基因组序列信息开发了 6 个新标记。与实验室之前发表的遗传图谱[19]相比,本研究在 Xgwm205 与基因之间新增了两个 gSSR 标记(Xmp1089 和 Xmp1112),将 Pm48界定在 Xmp510 和 Xmp1112 之间的 4.6 cM 之间,为基因的进一步分离奠定了基础。此外,还开发了一个与基因共分离的标记 Xmp928,该标记无论在小群体中还是在扩大的纯合感病家系中均与抗病基因共分离,将作为抗病基因 Pm48 的重要选择标记。Xmp928 是重复序列连接(repeat junction)类型的标记,这类标记在重复序列超过 80%的小麦基因组中非常丰富[27],将是小麦基因定位的重要标记类型,然而该类型标记无法与基因序列关联,很难为基因分离提供帮助。

简化测序可以降低测序成本,根据性状混池后测序更进一步降低成本。本研究利用 ddRAD 测序成功开发了 3 个 CAPS标记和 1 个 STS 标记,转化了与基因关联性强的 14 个 SNP 标记,其中 4 个(28.6%)为多态性标记,而其余标记没有多态性。对于没有转化成功的 10 个 SNP 标记,推测是由于 ddRAD 测序后获得的重复序列导致非特异性以及扩增引入的错配。本研究还利用粗山羊草基因组序列开发了 71 个 gSSR 标记,但只有 2 个被定位,多态率为 2.8%,远低于其他研究报道的 gSSR的多态率[28-30]。推测可能的原因,一是 D 基因组的多态性偏低[28-30],二是 Tabasco、宁糯麦 1 号两亲本的分子标记多态率低。对比上述两种方法,利用混池的 ddRAD 测序效率较高。

本研究利用 5DS 缺失系成功将抗病基因 Pm48 定位在小麦 5DS 0.63–0.67 的染色体区段中,这一区段的物理距离大约为55 Mb [31]。标记 Xcfd81 和 Xmp1112 相距 8.0 cM,假定两标记位于边界,该区域的重组率估算为 0.145 cM/Mb,低于 Erayman等[32]在该区域估算的重组率(0.341 cM/Mb),并非重组热点区域。尽管如此,该区段较小的物理距离仍然将有助于抗病基因的分离。本实验室将在以下两方面进一步研究,一是解决标记多态性低的问题,准备利用不同的感病亲本与 Tabasco 构建多个分离群体,构建 Pm48 的饱和遗传图谱;二是利用混池进行转录组测序,发掘 Pm48 候选基因。


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