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    发布时间: 2019 - 03 - 13
    合作单位:江苏大学食品与生物工程学院发表期刊:Food Chemistry影响因子:4.946(SCI二区)研究背景:桔霉素(citrinin,CIT)是一种次生代谢物,最初由桔青霉Penicillium citrinum生产。后来发现它是由曲霉属、红曲属、青霉属等产生的。一些农业食品中报告了CIT的污染情况,包括大米、奶酪、小麦、苹果和其他商业食品。食品中的CIT污染不仅造成重大经济损失,而且对人们构成肾毒性威胁。实验目的:比较10μg/mL CIT处理和不处理Cryptococcus podzolicus Y3的转录和蛋白质组,以揭示酵母对CIT的防御反应及CIT降解的分子机制。实验取材:CIT处理和不处理Cryptococcus podzolicus Y3酵母菌株组学:转录组学和蛋白组学主要研究成果01蛋白的差异表达分析在每个凝胶中总共检测到102个差异表达的蛋白质(平均fold change>1.2)。其中42个差异显著表达蛋白(平均fold change2,p2,p02差异表达蛋白的WEGO分类对所有已鉴定的蛋白质进行了GO功能注释分析,其中被鉴定为细胞和代谢过程的蛋白质为第1位,其次是生物调节和对刺激的反应。所涉及的许多细胞成分是细胞器、细胞成分和生物大分子。结合和催化功能是分子功能中识别最多的蛋白质,其次是抗氧化蛋白、电子携带蛋白、转运蛋白等。03基因的差异表达分析共获得了43928个转录物和17088个unigenes,其N50值分别为2844和2219(补充表S2)。所有基因均用BLAST软件进行注释,其中包括NR、Swissprot、GO、COG、KOG、Pfam和KEGG数据库。共有14550个基因被注释到数据库中。检测所有基因的表达水平,共获得1409个差异表达基因(DEGS,fold change2,p04基因的GO分类根据细胞...
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    发布时间: 2019 - 03 - 11
    摘要草莓属配子体不亲和系统的研究已经广为人知了,但是其遗传机制目前仍是未知的。通过人工自花授粉获得了11个不同亲和性的第二世代绿色草莓,用来代表不同的坐果率水平。本研究对两个较大差异坐果率的自交系进行全基因组重测序,Ls-S2-53(自交不亲和)和Ls-S2-76(强自交亲和)。利用完全自交亲和的野草莓作为参考样品,进行两个绿色草莓全基因组变异检测和注释分析。两测序样品间每条染色体上的多态分布都很相似,但是纯合变异的数量和分布区域是不一致的。基因表达分析表明6个和自交不亲和显著相关的候选基因,用野草莓基因组作为参考,将一个FIP2-like(肌动蛋白骨架合成相关)作为两个自交不亲和自交系的候选基因,该基因编码的肽链在两个材料中均存在不同长短的数量的氨基酸数量的丢失。通过抑制FIP2-like的表达减少了花粉管顶端F-actin的合成,在一定程度上抑制了花粉粒的生成和花粉管的发育。研究结果表明差异的纯合变异分布影响了绿色草莓的果实坐果率,完整编码的FIP2-like能够正常促进F-actin的合成,而较短氨基酸序列的FIP2-like对两个自花授粉草莓的亲和性有影响。材料方法植物材料:F.viridis 42,Ls-S1-2,11个Ls-S1-2自交系;测序材料:Ls-S2-53,Ls-S2-76(幼嫩叶片);Ls-S2-53人工自花授粉后(0h)叶、花梗、花萼、花瓣、雌蕊、花药用来做组织特异表达分析,雌蕊自花授粉后(6,12,24,48,72h)做时空表达分析。测序策略:Illumina Hiseq 2500,Ls-S2-53(80X),Ls-S2-76(75X)。参考基因组:F. vesca reference genome v2.0.a1;比对参考基因组:BWA v0.6.1,过滤冗余序列:SAMtools,变异检测:GATK,变异位点注释:SnpEff,基因功能注释:...
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    发布时间: 2019 - 01 - 29
    小基因组测序,等待您的加入!客户发表文章:”The Complete Plastid Genome of Magnolia zenii and Genetic Comparison to Magnoliaceae species“        壹俺们很优秀,无奈太低调,悄悄告诉您,俺们公司客户叶绿体文章又有一篇发表啦!集思慧远带着自主研发的叶绿体组装软件为您科研道路上添砖加瓦!下面小编就带您看看,一篇叶绿体文章如何造就!贰                      宝华玉兰的完整质体基因组及其与木兰科植物的遗传比较                           IF=3.098宝华玉兰是一种极度濒危物种,仅存于中国江苏省宝华山有18棵。关于它的分子生物学的信息很少,直到现在还没有对宝华玉兰进行质体基因组研究。本文通过对宝华玉兰(Magnolia Zenii)的完整叶绿体基因组进行测序组装,鉴定SSR,并通过对近缘物种基因组结构和序列数据的比较分析,揭示了5个突变热点,对今后木兰科的系统发育和进化研究具有重要意义。这篇文章的研究内容如下:1、叶绿体基因组组装宝华玉兰基因组长160,048 bp,GC含量为39.2%,包括一对26,596 bp的反向重复区(IRA和IRB),一个大单拷贝区(LRC)88,098 bp,一个小单拷贝区(SSC)18,757 bp.2、木兰科物种叶绿体基因组比较分析用28种木兰科物种和2种鹅掌楸的叶绿体基因组进行序列比对。宝华玉兰的叶绿体基因组放...
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    发布时间: 2019 - 01 - 28
    摘要油菜是一种重要的油料作物,为了适应不同的气候带和纬度,形成了三种主要的生态型(冬性,半冬性,春性)。这些生态型多样性背后的遗传机制目前还是未知的。本研究这对收集的世界各地的991份资源品种进行全基因组重测序并分析了这些资源的遗传多样性。测序结果分别和油菜“Darmor-bzh”,“Tapidor”基因组比对鉴定到5.56M/5.53M SNPs,1.86M/1.92M Indels。文章通过构建等位基因漂变图揭示主要群落的,利用遗传多样性和连锁不平衡参数研究了甘蓝型油菜两个亚基因组的非对称进化。选择性清除分析表明了调控各种植物发育和胁迫的直系同源基因间的遗传多样性。全基因组关联分析发现在FT和FLC同源基因的启动子区域的SNP,符合不同生态型的油菜。材料方法实验材料:来自39个国家,658种冬性、145种半冬性、188种春性油菜。测序策略:Illumina HiSeq Xten PE150,共7.9T(平均测序深度6.6X)。油菜参考基因组:‘‘Darmor-bzh’’ genome (B. napus v4.1 genome),‘‘Tapidor’’genome。系统发育分析:MEGA5.2(NJ树,Kimura 2-parameter model);LD分析:PLINK,群体结构:ADMIXTURE;PCA:EIGENSOFT(smartPCA)。SNP重组率计算:R package FastEPRR;等位基因漂移分析:TREEMIX,基因流画图:R package ggplot2。选择性清除:PopGenome(Fst),XP-CLR;关联分析:TASSEL(MLM)。研究结果1、991份油菜资源群体结构和遗传变异A/B.991份油菜资源全球分布情况及对应三种生态型;C.991份材料的系统进化分析(与油菜生态型大致相同);D.群体主成分分析,PC1能够区分冬性和半...
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    发布时间: 2018 - 12 - 13
    发表期刊:Postharvest Biology and Technology影响因子:IF=3.112(SCI二区)研究背景草莓(Fragaria×ananassa Duch.)由于其独特的风味和多汁的质地,是一种在世界范围内广受欢迎的园艺作物。它是维生素C和抗氧化剂的良好来源,但由于软化快、机械损坏、真菌腐烂和采后代谢迅速,很容易腐烂。在6℃贮藏1d后,草莓果实中的蔗糖水平由于快速的采后代谢而达到无法检测的水平。虽然草莓品种的贮藏期不同,但平均贮藏期通常只有3-5d。先前研究报道了CO2诱导的生理和机械变化,收获后,草莓果实中含有较高水平的二氧化碳(CO2)以提高可储存性。暴露于20%CO2中12或48h的草莓果实比在环境空气中贮藏3d的水果更结实。高浓度的二氧化碳会影响细胞壁钙的结合,提高果实的硬度。为了深入了解高浓度CO2在分子和生化水平上的影响,多学科方法是必要的。整合基因组学、蛋白质组学和代谢组学将有助于更好地理解植物对外界刺激的全面定性和定量反应。尽管对草莓果实采后对高CO2的响应进行了研究,但对细胞反应的全面了解仍不甚清楚。本研究联合转录组学和代谢组学方法来研究分子和细胞反应,将收获的草莓果实短期暴露于30%CO2,以全面了解改善的果实耐贮性。材料与方法01植物材料与CO2处理草莓于80%红色收获,收获后,果实立即运往实验室。选择大小和颜色一致的果实作为试验材料。分组:0D:环境空气0h(收获后立即)1D:3h环境空气处理后1d1DT:3h 30%CO2处理后1d 02硬度测定随机抽取3个重复容器中的10个草莓果实进行硬度测定(n=30),经硬度测定后丢弃。采用CT-3纹理分析仪进行硬度测量。用直径为100mm、速度为2mm、应变为5mm、直径为100 mm的平板探针,在果实赤道面测量果实硬度(N)。草莓果实表面微生物...
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    发布时间: 2018 - 12 - 13
    集思慧远客户发表——《王枣子根、茎和叶的比较转录组分析揭示了王枣子素生物合成的候选基因》英文标题:Comparative transcriptome analysis of roots, stems and leaves Isodon amethystoides reveals candidate genes involved in Wangzaozins biosynthesis杂志:BMC PLANT BIOLOGY影响因子:IF=3.930摘要    王枣子是一种重要的中药植物,具有治疗多种疾病的药理作用,包括肺结核。四环二萜类化合物王枣子素(王枣子甲素Wang zaozin A,王枣子乙素GlucocalyxB)是王枣子的主要生物活性化合物。然而,关于这些化合物生物合成的分子信息仍然不清楚。通过对王枣子中王枣子素积累水平的研究,发现该植物的根、茎和叶组织有很大的变化,表明不同组织间代谢产物生物合成和积累的可能存在差异。为了更好地阐明四环二萜生物合成途径,我们对根、茎和叶组织进行转录组测序,并进行了de novo序列组装和分析。分析了与二萜类生物合成有关的候选基因,如CPS、KSL等。用qRT-PCR方法对8种涉及四环二萜类生物合成的转录本在王枣子不同组织中的表达谱进行了验证,解构该通路的基因表达谱。ISPD、ISPF和ISPH(MEP途径)以及IaCPS和IaKSL(二萜类途径)候选基因在叶片和根中的差异表达,可能是造成王枣子叶片中王枣子素积累较高的原因之一。本文报道的基因组数据和分析为进一步研究这一重要药用植物奠定了基础。材料与方法植物材料:一年生健康王枣子个体的根、茎、叶(3个重复)王枣子素的提取与鉴定(靶标代谢):种类:王枣子甲素、王枣子乙素和王枣子丙素        &...
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斑马鱼和猪早期胚胎发育期间有丰富的DNA 6mA甲基化

日期: 2017-02-17
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摘要:

DNA N6-甲基脱氧腺苷(6mA)主要是原核(细菌)DNA修饰,(以往的研究表明5mC修饰在调控哺乳动物基因表达中起着非常重要的作用;而6mA修饰广泛存在于细菌中,在DNA复制、修复、基因表达调控及宿主-病原体相互拮抗等方面发挥重要的功能。6mA修饰方式在高等真核生物基因组中由于其含量极低,因此其研究一直被忽视。)目前已经发现其在真核DNA中存在并发挥表观遗传的作用。本文研究表明,在脊椎动物的早期胚胎发育期间,6mA累积到总脱氧腺苷的0.1-0.2%,但随着胚胎发育,逐渐减少。在此过程中,大部分的6mAs位于基因组的重复区域。

 

方法:

收集斑马鱼早期胚胎分离gDNA

将未受精的精子从麻醉的雄性中挤出,将卵母细胞从麻醉的雌性中挤出。受精胚在28.5℃Holtfreter's溶液中生长,并根据标准形态学标准分期。将卵母细胞和不同阶段的胚胎在液氮中冷冻,直到收集到足够的胚胎用于DNA提取。

 

猪卵母细胞采集和体外成熟

在屠宰场收集青春期前母猪的卵巢。用注射器吸出3-6mm的窦卵泡,收集卵丘-卵母细胞复合体(COCs)。用PVA-TL-HEPES培养基洗涤三次再用TCM-199培养基洗涤两次。随后,在5CO2的潮湿气氛中38.5℃下不含激素的TCM-199培养基中使COCs成熟42- 44小时。然后,在工作溶液(0.03g透明质酸酶,5.46g甘露醇,0.001g BSA5ml PVA-TL-HEPES95ml ddH2O)中洗涤COC以除去卵丘细胞,并取出成熟卵母细胞,-80℃冻存。

体外受精。

体外成熟后,用2ml新鲜IVF培养基轻轻洗涤COC以除去卵丘细胞。洗涤后,将裸露的卵母细胞置于50μL矿物油覆盖的IVF培养基中。将卵母细胞在38.5℃5CO2下孵育30分钟,直到加入精子。将卵母细胞与精子在IVF培养基中在38.5℃5CO2下孵育6小时。然后,将其转移到500μL PZM-3培养基中,再培养2天至4细胞期,4天至桑椹胚期,7天至囊胚期,-80℃冻存。

 

通过UHPLC-QQQ-MS/MS定量测定gDNA中的6mA

将在26μL不含核酸酶的H2O中的斑马鱼胚胎gDNA20300ng)或组织gDNA12μg)在100℃变性5分钟,在冰上冷却2分钟,用1μL核酸酶P1消化,10mM NH4OAc pH 5.3中于42℃过夜。之后加入3.4μLNH4HCO31M)和1μL的磷酸二酯酶I37℃下培养2小时,最后加入1 U碱性磷酸酶在37℃培养2小时。将消化DNA用不含核酸酶的H2O稀释两倍,并通过0.22mm过滤器(MilliporeSLGVR04NL)过滤。将10μL样品注入LC-MS/MS中,并且通过反相UHPLCC18柱(Agilent927,700-092)上分离核苷,使用Agilent 6,460 QQQ-MS/MS在正电喷雾离子化模式下进行多反应监测。使用核苷前体离子鉴定碱基离子质量跃迁266.1-150.06mA252.1-136.0A。从同时运行的核苷标准获得的校准曲线进行6mA/A的定量。

 

抗体。

对于常规6mA-IP-seq,使用以下两种兔多克隆抗-6mA抗体:Synaptic SystemsSYSY202,003)和Abcamab151,230。对于免疫染色实验,使用兔6mA抗体(SYSY202,003)和小鼠单克隆组蛋白3H3)抗体(Beijing Biodragon ImmunotechnologiesB1055F)。

 

免疫染色和共聚焦成像。

对于6mA免疫染色,将斑马鱼胚胎在4%多聚甲醛中4℃固定过夜。然后去除胚胎并用甲醇脱水并用PBS再水,用含有1Triton X-100PBS透化该胚15分钟。透化的胚胎用2M HCl变性1小时,然后用100mM Tris-HClpH8.5)中和20分钟。洗涤胚胎,然后用封闭缓冲液温育1小时。之后,将胚胎与6mA抗体(1:1000SYSY抗体)在4℃下孵育过夜。用PBS洗涤三次,将胚胎与1:2000稀释的第二抗体(山羊抗兔Alexa488Molecular Probes)孵育。使用Nikon软件在Nikon Eclipse TI显微镜下获取图像。

对于猪精子、卵母细胞和胚胎免疫染色,配子和胚胎用PBS洗涤,用PBS中的4%多聚甲醛固定15分钟,并在室温下用0.1Triton X-100PBS中透化15分钟。将透化的配子和胚在室温下在4M HCl溶液中温育15分钟,然后在100mM Tris-ClpH 8.0中中和30分钟。封闭并用抗-6mA抗体孵育过夜后,将它们洗涤并与二抗温育。用DAPI染色细胞核。使用共焦激光扫描显微镜观察免疫荧光。

 

6mA斑点印迹测定。

斑点印迹一种定性检测核酸或蛋白质的技术。将待测核酸或蛋白点样于固相载体上,以同位素或非同位素标记探针与之杂交,通过显影或显色而进行检测。

98℃加热10分钟使DNA变性,并点在硝酸纤维素膜(GE Healthcare)上。将膜在80℃烘烤1小时并通过紫外线照射交联,将膜在含有0.5Tween 20PBST)的PBS中的5BSA中在室温封闭1.5小时,然后与1:10,000稀释的6mA抗体(SYSY)在4℃过夜。用PBST洗涤三次后,将膜与1:5000稀释的辣根过氧化物酶缀合的抗兔二抗孵育。然后用PBST洗涤膜并用增强的化学发光(ECL)处理。为了估计在不同阶段的斑马鱼gDNA6mA的水平,用未甲基化的寡核苷酸稀释合成的含有6mADNA寡核苷酸,以产生具有6mA含量(0.2,0.1,0.05,0.025,0.01250.00625%)的梯度的标准品。所有样品和标准品以相同的量装载。在我们测试的样品中,64细胞,256细胞,球体,13hpf24hpf阶段的gDNA分别具有约0.05,0.01,0.004,0.0020.002%的6mA水平,这与LC- MS / MS观察一致。

6mADNA寡核苷酸:

5’-TTGCT6mAGGTGGTTGCT6mAGGCGGTTGCT6mAGGGT-3

 

DNA 6mA-IP-seq和生物信息学分析。

Illumina HiSeq2500平台上进行50bp单端测序。使用Bowtie v1.0.1将原始序列比对到参考基因组(zv10/danRer10,用于斑马鱼)。然后用MACS软件通过比较来自IP样品的读数与来自输入样品的读数来鉴定富集区域(6mA峰)。假发现率截止值设置为0.01,以选择统计学显着的峰。在获得这些峰区域之后,将基因座与从RepeatMasker数据库下载的重复元件的坐标进行比较。如果一个峰区域的一半以上的长度与一个注释的重复元件重叠,则将峰标记为重复起始峰。基因注释信息从UCSC数据库下载。分布在每个基因组区域中的峰的富集通过HOMERMotgeEnrichmentHypergeometric Optimization)软件

 

结果:

1、 斑马鱼、猪早期胚胎发育期间DNA 6mA修饰

使用超高效液相色谱与三重四极杆串联质谱法纯化和定量基因组DNAgDNA)(UHPLC-MS / MS / MS)测定,纯6mA核苷作为外标。

使用斑点印迹测定斑马鱼早期发育阶段的6mA水平,显示与LC-MS / MS实验一致的结果。

通过UHPLC-QQQ-MS / MS定量斑马鱼和猪的基因组DNA中的6mA

a)从1细胞到512细胞的斑马鱼胚胎阶段的6mA丰度。从1细胞合子开始,DNA6mA的水平随着发育进一步增加,并在对应于受精后2h32细胞至64细胞胚胎阶段达到最大值。然后,6mA水平在512细胞阶段逐渐降低

b)来自成年斑马鱼的各种组织的6mA丰度。所有6mA丰度都相对较低。

c)来自成年猪的各种组织的6mA丰度。所有6mA丰度都相对较低。

斑马鱼和猪早期胚胎发育期间有丰富的DNA 6mA甲基化 

 

2、 斑马鱼、早期胚胎中DNA 6mA水平的定量

通过UHPLC-QQQ-MS/MS对来自斑马鱼(a)和猪(c的精子、卵母细胞和各种胚胎阶段的分离gDNA中的6mA修饰进行定量。

bd)通过抗6mA抗体(绿色,兔多克隆)和抗组蛋白3H3)抗体红色,小鼠单克隆)染色的单细胞水平的斑马鱼(b)和猪(d)的各个胚胎期的免疫荧光图像。早期胚胎阶段显示强的荧光,表明gDNA6mA丰度较高,而信号随着胚胎发育的进展而减弱。

斑马鱼和猪早期胚胎发育期间有丰富的DNA 6mA甲基化 

 

3、 DNA 6mA-IP-seq显示6mA在斑马鱼各个胚胎阶段的基因组分布

64C11hpf12hpf13hpf的样品中鉴定了57,0003,3006mA峰,其中64C样品具有最多的峰,与6mA丰度测量一致。通常,6mA峰在转录起始位点(TSS)之后在基因组中广泛分布并具有轻微富集,并且它们被发现在外显子富集,但不是内含子,基因间或启动子区富集。发现78-81%的峰位于重复元素(RE)中,表明6mARE之间的密切关系。

a)饼图显示64细胞期6mA峰的分布。

b64C11hpf12hpf13hpf本中6mA分类。显示了基因组分布用于比较。峰用a中所示的相同标准分类。与基因组中RE区域的构成相比,6mA峰在简单重复序列、RC/Helitron(滚环转座子)LTR(长末端重复反转录转座子)LINE/L1(长散元件)和DNA/Maverick病毒样DNA转座子)类的RE富集。

c64C阶段样品中,简单重复、除了简单重复之外的其他RE和非重复区域(非RE)的6mA峰的序列motif。通过Homer软件搜索和产生基序。

为了寻找6mA的序列偏好,对6mA峰区域进行基序分析。考虑到RE和非RE区域之间的序列多样性,将峰分为三组:简单重复区除简单重复之外的其他RE区和与RE不相关的区(非RE)。发现每个组的motif均不同。在简单重复中,串联CA基序是最普遍的,其后是串联的5’-TCCA-3’5’-CCAA-3’基序。

斑马鱼和猪早期胚胎发育期间有丰富的DNA 6mA甲基化 

 

4、 选择含有6mA的靶基因

为了研究富集6mAREs的表达与积累的时间之间的相关性,选择了几个靶基因,并用qPCR来定量其在各种发育阶段的转录物表达水平。在所选择的靶基因中,Thy1LTR/GypsyParp4LTR/Gypsy)和Hel1RC/Helitron)都显示随着发育、表达减少的趋势。这些数据表明REs的表达可能与6mA丰度正相关。

斑马鱼和猪早期胚胎发育期间有丰富的DNA 6mA甲基化 

 

亮点分析:

16mA作为原核DNA标记研究较为充分。在大肠杆菌中,6mA参与染色体复制,核型分离,错配修复和转录调节的控制。6mA也存在于真核生物中,并且似乎具有功能性作用。

2、研究表明,在斑马鱼和猪的早期胚胎发育期间,6mA可以积累到0.1-0.2%。卵母细胞中6mA的水平比精子的水平高几倍,并且在合子形成后,6mA的丰度增加,然后随着胚胎发育降低。

36mA优先选择在REs中富集,其表达可能与6mA丰度正相关。观察到的最高丰度6mA水平接近于在大多数哺乳动物组织中观察到的5hmC水平。未来的研究应该揭示6mA如何与哺乳动物的5mC重编程相关,6mAREs和其他区域的作用,某些蛋白可能结合6mA以介导生物学功能。

 

参考文献:

Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig.

2016-nature communication-11.329

 

斑马鱼和猪早期胚胎发育期间有丰富的DNA 6mA甲基化

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