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    发布时间: 2019 - 03 - 13
    合作单位:江苏大学食品与生物工程学院发表期刊:Food Chemistry影响因子:4.946(SCI二区)研究背景:桔霉素(citrinin,CIT)是一种次生代谢物,最初由桔青霉Penicillium citrinum生产。后来发现它是由曲霉属、红曲属、青霉属等产生的。一些农业食品中报告了CIT的污染情况,包括大米、奶酪、小麦、苹果和其他商业食品。食品中的CIT污染不仅造成重大经济损失,而且对人们构成肾毒性威胁。实验目的:比较10μg/mL CIT处理和不处理Cryptococcus podzolicus Y3的转录和蛋白质组,以揭示酵母对CIT的防御反应及CIT降解的分子机制。实验取材:CIT处理和不处理Cryptococcus podzolicus Y3酵母菌株组学:转录组学和蛋白组学主要研究成果01蛋白的差异表达分析在每个凝胶中总共检测到102个差异表达的蛋白质(平均fold change>1.2)。其中42个差异显著表达蛋白(平均fold change2,p2,p02差异表达蛋白的WEGO分类对所有已鉴定的蛋白质进行了GO功能注释分析,其中被鉴定为细胞和代谢过程的蛋白质为第1位,其次是生物调节和对刺激的反应。所涉及的许多细胞成分是细胞器、细胞成分和生物大分子。结合和催化功能是分子功能中识别最多的蛋白质,其次是抗氧化蛋白、电子携带蛋白、转运蛋白等。03基因的差异表达分析共获得了43928个转录物和17088个unigenes,其N50值分别为2844和2219(补充表S2)。所有基因均用BLAST软件进行注释,其中包括NR、Swissprot、GO、COG、KOG、Pfam和KEGG数据库。共有14550个基因被注释到数据库中。检测所有基因的表达水平,共获得1409个差异表达基因(DEGS,fold change2,p04基因的GO分类根据细胞...
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    发布时间: 2019 - 03 - 11
    摘要草莓属配子体不亲和系统的研究已经广为人知了,但是其遗传机制目前仍是未知的。通过人工自花授粉获得了11个不同亲和性的第二世代绿色草莓,用来代表不同的坐果率水平。本研究对两个较大差异坐果率的自交系进行全基因组重测序,Ls-S2-53(自交不亲和)和Ls-S2-76(强自交亲和)。利用完全自交亲和的野草莓作为参考样品,进行两个绿色草莓全基因组变异检测和注释分析。两测序样品间每条染色体上的多态分布都很相似,但是纯合变异的数量和分布区域是不一致的。基因表达分析表明6个和自交不亲和显著相关的候选基因,用野草莓基因组作为参考,将一个FIP2-like(肌动蛋白骨架合成相关)作为两个自交不亲和自交系的候选基因,该基因编码的肽链在两个材料中均存在不同长短的数量的氨基酸数量的丢失。通过抑制FIP2-like的表达减少了花粉管顶端F-actin的合成,在一定程度上抑制了花粉粒的生成和花粉管的发育。研究结果表明差异的纯合变异分布影响了绿色草莓的果实坐果率,完整编码的FIP2-like能够正常促进F-actin的合成,而较短氨基酸序列的FIP2-like对两个自花授粉草莓的亲和性有影响。材料方法植物材料:F.viridis 42,Ls-S1-2,11个Ls-S1-2自交系;测序材料:Ls-S2-53,Ls-S2-76(幼嫩叶片);Ls-S2-53人工自花授粉后(0h)叶、花梗、花萼、花瓣、雌蕊、花药用来做组织特异表达分析,雌蕊自花授粉后(6,12,24,48,72h)做时空表达分析。测序策略:Illumina Hiseq 2500,Ls-S2-53(80X),Ls-S2-76(75X)。参考基因组:F. vesca reference genome v2.0.a1;比对参考基因组:BWA v0.6.1,过滤冗余序列:SAMtools,变异检测:GATK,变异位点注释:SnpEff,基因功能注释:...
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    发布时间: 2019 - 01 - 29
    小基因组测序,等待您的加入!客户发表文章:”The Complete Plastid Genome of Magnolia zenii and Genetic Comparison to Magnoliaceae species“        壹俺们很优秀,无奈太低调,悄悄告诉您,俺们公司客户叶绿体文章又有一篇发表啦!集思慧远带着自主研发的叶绿体组装软件为您科研道路上添砖加瓦!下面小编就带您看看,一篇叶绿体文章如何造就!贰                      宝华玉兰的完整质体基因组及其与木兰科植物的遗传比较                           IF=3.098宝华玉兰是一种极度濒危物种,仅存于中国江苏省宝华山有18棵。关于它的分子生物学的信息很少,直到现在还没有对宝华玉兰进行质体基因组研究。本文通过对宝华玉兰(Magnolia Zenii)的完整叶绿体基因组进行测序组装,鉴定SSR,并通过对近缘物种基因组结构和序列数据的比较分析,揭示了5个突变热点,对今后木兰科的系统发育和进化研究具有重要意义。这篇文章的研究内容如下:1、叶绿体基因组组装宝华玉兰基因组长160,048 bp,GC含量为39.2%,包括一对26,596 bp的反向重复区(IRA和IRB),一个大单拷贝区(LRC)88,098 bp,一个小单拷贝区(SSC)18,757 bp.2、木兰科物种叶绿体基因组比较分析用28种木兰科物种和2种鹅掌楸的叶绿体基因组进行序列比对。宝华玉兰的叶绿体基因组放...
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    发布时间: 2019 - 01 - 28
    摘要油菜是一种重要的油料作物,为了适应不同的气候带和纬度,形成了三种主要的生态型(冬性,半冬性,春性)。这些生态型多样性背后的遗传机制目前还是未知的。本研究这对收集的世界各地的991份资源品种进行全基因组重测序并分析了这些资源的遗传多样性。测序结果分别和油菜“Darmor-bzh”,“Tapidor”基因组比对鉴定到5.56M/5.53M SNPs,1.86M/1.92M Indels。文章通过构建等位基因漂变图揭示主要群落的,利用遗传多样性和连锁不平衡参数研究了甘蓝型油菜两个亚基因组的非对称进化。选择性清除分析表明了调控各种植物发育和胁迫的直系同源基因间的遗传多样性。全基因组关联分析发现在FT和FLC同源基因的启动子区域的SNP,符合不同生态型的油菜。材料方法实验材料:来自39个国家,658种冬性、145种半冬性、188种春性油菜。测序策略:Illumina HiSeq Xten PE150,共7.9T(平均测序深度6.6X)。油菜参考基因组:‘‘Darmor-bzh’’ genome (B. napus v4.1 genome),‘‘Tapidor’’genome。系统发育分析:MEGA5.2(NJ树,Kimura 2-parameter model);LD分析:PLINK,群体结构:ADMIXTURE;PCA:EIGENSOFT(smartPCA)。SNP重组率计算:R package FastEPRR;等位基因漂移分析:TREEMIX,基因流画图:R package ggplot2。选择性清除:PopGenome(Fst),XP-CLR;关联分析:TASSEL(MLM)。研究结果1、991份油菜资源群体结构和遗传变异A/B.991份油菜资源全球分布情况及对应三种生态型;C.991份材料的系统进化分析(与油菜生态型大致相同);D.群体主成分分析,PC1能够区分冬性和半...
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    发布时间: 2018 - 12 - 13
    发表期刊:Postharvest Biology and Technology影响因子:IF=3.112(SCI二区)研究背景草莓(Fragaria×ananassa Duch.)由于其独特的风味和多汁的质地,是一种在世界范围内广受欢迎的园艺作物。它是维生素C和抗氧化剂的良好来源,但由于软化快、机械损坏、真菌腐烂和采后代谢迅速,很容易腐烂。在6℃贮藏1d后,草莓果实中的蔗糖水平由于快速的采后代谢而达到无法检测的水平。虽然草莓品种的贮藏期不同,但平均贮藏期通常只有3-5d。先前研究报道了CO2诱导的生理和机械变化,收获后,草莓果实中含有较高水平的二氧化碳(CO2)以提高可储存性。暴露于20%CO2中12或48h的草莓果实比在环境空气中贮藏3d的水果更结实。高浓度的二氧化碳会影响细胞壁钙的结合,提高果实的硬度。为了深入了解高浓度CO2在分子和生化水平上的影响,多学科方法是必要的。整合基因组学、蛋白质组学和代谢组学将有助于更好地理解植物对外界刺激的全面定性和定量反应。尽管对草莓果实采后对高CO2的响应进行了研究,但对细胞反应的全面了解仍不甚清楚。本研究联合转录组学和代谢组学方法来研究分子和细胞反应,将收获的草莓果实短期暴露于30%CO2,以全面了解改善的果实耐贮性。材料与方法01植物材料与CO2处理草莓于80%红色收获,收获后,果实立即运往实验室。选择大小和颜色一致的果实作为试验材料。分组:0D:环境空气0h(收获后立即)1D:3h环境空气处理后1d1DT:3h 30%CO2处理后1d 02硬度测定随机抽取3个重复容器中的10个草莓果实进行硬度测定(n=30),经硬度测定后丢弃。采用CT-3纹理分析仪进行硬度测量。用直径为100mm、速度为2mm、应变为5mm、直径为100 mm的平板探针,在果实赤道面测量果实硬度(N)。草莓果实表面微生物...
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    发布时间: 2018 - 12 - 13
    集思慧远客户发表——《王枣子根、茎和叶的比较转录组分析揭示了王枣子素生物合成的候选基因》英文标题:Comparative transcriptome analysis of roots, stems and leaves Isodon amethystoides reveals candidate genes involved in Wangzaozins biosynthesis杂志:BMC PLANT BIOLOGY影响因子:IF=3.930摘要    王枣子是一种重要的中药植物,具有治疗多种疾病的药理作用,包括肺结核。四环二萜类化合物王枣子素(王枣子甲素Wang zaozin A,王枣子乙素GlucocalyxB)是王枣子的主要生物活性化合物。然而,关于这些化合物生物合成的分子信息仍然不清楚。通过对王枣子中王枣子素积累水平的研究,发现该植物的根、茎和叶组织有很大的变化,表明不同组织间代谢产物生物合成和积累的可能存在差异。为了更好地阐明四环二萜生物合成途径,我们对根、茎和叶组织进行转录组测序,并进行了de novo序列组装和分析。分析了与二萜类生物合成有关的候选基因,如CPS、KSL等。用qRT-PCR方法对8种涉及四环二萜类生物合成的转录本在王枣子不同组织中的表达谱进行了验证,解构该通路的基因表达谱。ISPD、ISPF和ISPH(MEP途径)以及IaCPS和IaKSL(二萜类途径)候选基因在叶片和根中的差异表达,可能是造成王枣子叶片中王枣子素积累较高的原因之一。本文报道的基因组数据和分析为进一步研究这一重要药用植物奠定了基础。材料与方法植物材料:一年生健康王枣子个体的根、茎、叶(3个重复)王枣子素的提取与鉴定(靶标代谢):种类:王枣子甲素、王枣子乙素和王枣子丙素        &...
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使用高效离子色谱结合Q轨道离子阱HF质谱仪研究头部和颈部癌细胞的靶向代谢组学分析

日期: 2016-12-29
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 摘要

在这项研究中,我们已经证明了基于高效离子色谱(IC)分离,轨道离子阱HFMS的靶向代谢组学方法用于高分辨率和精确质量(HR/AM)测量的癌细胞分析并使用稳定同位素标记的内标进行绝对定量。该方法为代谢物分析提供了巨大的技术优势,包括精确的灵敏度,高速和再现性,以及广泛的动态范围。高性能IC提供了在20分钟内对细胞代谢物快速分离,并为极性分子(包括许多同位素代谢物)提供了极好的分离能力。IC/QExactive HFMS实现了6个目标代谢物,丙酮酸盐,琥珀酸,苹果酸,柠檬酸,延胡索酸和α淀粉酸的5个数量级广泛的动态范围,R2≈0.99。基于该平台,可以在细胞样品中从低fmol/μLnmol/μL水平同时定量代谢物。380μL/min的高流速IC对于大量样品(150次进样)显示出极好的重复性,保留时间的变化最小(SD<±0.03min)。此外,基于IC-MS的方法在同一时间分析运行中获得目标和全代谢组学数据,并使用稳定同位素标记的标准品帮助大规模代谢组学分析中靶向代谢物的精确定量。这种代谢组学方法已成功应用于头颈癌细胞以及癌症干细胞类细胞(CSCs)中目标代谢物的分析,并且结果表明代谢表型在高和低侵入性头颈癌之间以及CSCs和非SCCs(非干细胞癌细胞)之间可以明显区分。

材料方法

样品制备

使用球形化测定法来富集和分离来自培养的UM1癌细胞的干细胞类口腔癌细胞(CSC)和非干细胞癌细胞(NSCCUM1UM2UM5UM6 头颈癌细胞培养在含有10%胎牛血清,青霉素(100U / mL)和链霉素(100μg/ mL)的改良Eagle培养基(DMEM)中。细胞维持在37℃下,湿润为5CO2培养箱中,并且当它们达到90-95%融合时进行传代。 用细胞活力分析仪计数细胞数。

使用液氮快速冷冻甲醇/水提取的细胞代谢物。在冷室中用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)快速洗涤两次以除去培养基组分,然后用水快速漂洗。除去水后,将细胞用液氮和1.0mL 90%冷MeOH快速冷冻;然后立即向每个板中加入CHCl3,并用细胞刮擦/悬浮细胞。将提取物转移至微量离心管中并在4℃下以16100g沉淀3分钟。然后将上清液转移到新离心管中进行IC-MS分析。所有实验重复312

稳定同位素标记的内标由Cambridge Isotope 实验室提供。 六种稳定同位素标记的标准品包括丙酮酸,苹果酸,延胡索酸,琥珀酸,α-酮戊二酸和柠檬酸以相同浓度合并,然后连续稀释,范围为10000,5000,1000,500,100,50,10,5,10.50.1pg /μL(总共11次稀释)。将11个连续稀释的标准品混合物随机掺入细胞代谢物样品中(至少3个重复),用于癌细胞中靶向代谢物的绝对定量。

离子色谱法

Dionex ICS-5000 + HPIC离子色谱Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪偶联,用于靶向代谢组学分析。

质谱分析法

  Q Exactive HF质谱仪在ESI负离子模式下操作用于所有检测

数据处理

        在全扫描模式下采集数据。使用Thermo Scientific SIEVE 2.2软件进行总体数据的差异分析。使用Thermo Scientific Tracefinder 3.2软件进行目标化合物的定性和定量分析。简而言之,将六种同位素标记的化合物输入Tracefinder局部化合物数据库并与目标化合物匹配。 然后基于同位素标记的标准品建立标准曲线,以对目标化合物绝对定量。

 

结果与讨论

使用高效离子色谱结合Q轨道离子阱HF质谱仪研究头部和颈部癌细胞的靶向代谢组学分析

 

 

Figure 1.A)用Q Exactive HF MS通过IC分析六种稳定同位素标记的标准品。

B)这些标准品化合物包括丙酮酸和三羧酸循环的中间体(琥珀酸,苹果酸,柠檬酸,延胡索酸和α-酮戊二酸)。

 

1 用于本研究的六种稳定同位素标记的标品

 使用高效离子色谱结合Q轨道离子阱HF质谱仪研究头部和颈部癌细胞的靶向代谢组学分析

 

代谢组学分析的高性能IC

糖单磷酸盐和二磷酸盐的成功分离是IC方法对代谢物分离质量很好的检测

 

使用高效离子色谱结合Q轨道离子阱HF质谱仪研究头部和颈部癌细胞的靶向代谢组学分析 

Figure2.A)高分辨率IC结合Q Exactive HF MSUM1癌细胞中11种糖单磷酸盐和(B9种糖二磷酸盐进行分析。基于与标准品化合物匹配的MS/MS(插图)和保留时间,在7.94min洗脱的9被鉴定为果糖-6-磷酸Q Exactive HF MS在负离子模式(<1ppm)下提供了母离子和产物离子的精确质量测定。基于与METLIN数据库匹配的MS/MS谱图或与标准化合物匹配的MS/MS谱图和保留时间鉴定的糖单磷酸盐或二磷酸盐。(C)具有大量进样次数(n=150)的果糖-6-磷酸(图2A中的峰9IC分析的再现性。果糖-6-磷酸的保留时间平均值为7.93±0.03minn=150)。

定量目标代谢组学流程

 使用高效离子色谱结合Q轨道离子阱HF质谱仪研究头部和颈部癌细胞的靶向代谢组学分析

Figure3.基于高性能IC结合Q Exactive HF MS的靶向代谢组学方法用于HR/AM测量,以及使用稳定同位素标记的内标进行代谢物的定量。

使用具有稳定同位素标记的内标物的IC-HR/AM(高分辨率/精确质量)-MS进行代谢物定量。将六种稳定的同位素标记的标准品以相同浓度混合,然后连续稀释,范围为10000,5000,1000,500,100,50,10,5,1,0.50.1pg/μL。然后将11个连续稀释的标准混合物随机加入细胞代谢组样品中,至少3个重复,对癌细胞中的6种目标代谢物进行绝对定量。在一系列稀释的标准品基础上,我们建立了每个内标的标准曲线,然后使用Tracefinder3.2程序,可以很容易地将内源代谢物与相应的同位素标记内标匹配,并准确定量其在细胞中的水平。

尽管本研究的重点是靶向代谢组学分析,但IC-HR/AM-MS方法允许在癌细胞中进行全代谢物分析。因此,每种细胞类型的全代谢分析数据也可用于非靶向代谢组学分析。虽然HR/AM全扫描MS数据可以用于靶向定量分析,但是相同的数据也可以重新用于非靶向分析和/或再处理用于额外的目标化合物靶向定量分析。

 

 使用高效离子色谱结合Q轨道离子阱HF质谱仪研究头部和颈部癌细胞的靶向代谢组学分析

Figure 4. 6种稳定同位素标记标准品的5个数量级的广泛动态范围。从一系列11个稀释的标准品混合物0.1,0.5,1,5,10,50,100,500,1000,500010000pg /μL浓度范围建立校准曲线。

为了从UM1UM2UM5UM6UM1-CSCUM1-NSCC细胞制备的代谢组样品中定量目标代谢物,将连续稀释的同位素标记混合物掺入细胞代谢物组样品中,然后进样IC/Q Exactive HF MS用于定量分析。对于每个浓度水平的内标混合物进行加标实验,至少需要3个生物学重复,并且使用Tracefinder分析IC-MS数据。图4显示了六种稳定同位素标记标准品的标准曲线。Q Exactive HF MS允许定量这些目标分子至低fmol水平,具有5个数量级的广泛动态范围。定量范围在0.1-10000pg/uL内,其非常适合于癌细胞中的内源性代谢物的综合分析。

 使用高效离子色谱结合Q轨道离子阱HF质谱仪研究头部和颈部癌细胞的靶向代谢组学分析

Figure 5. 通过IC-Q Exactive HF MS对头颈癌细胞中6种靶向代谢物的定量分析。 这些代谢物在UM5癌细胞中的生成显著高于其他细胞系。 插图为所有4个细胞系的培养物。 最初平铺的细胞数目相等并且培养时间相同。

在靶向分析的基础上,与UM2细胞相比,UM1细胞显示出更高的TCA代谢物水平,包括苹果酸,延胡索酸,柠檬酸和琥珀酸。然而,UM5细胞比其他细胞系(包括UM6)显示出所有六种代谢物更高的显著水平。我们发现与其他三种细胞系相比,UM5细胞中苹果酸,柠檬酸,延胡索酸和α-淀粉酸的水平至少高2倍(图5),而丙酮酸水平几乎增加了20倍。这似乎表明UM5细胞具有更积极的代谢表型,特别是丙酮酸的生成。如图5中所示UM5细胞培养物颜色显著改变,其细胞培养物pH显著低于UM1UM2UM6细胞培养物,这是由于UM5细胞中丙酮酸盐/乳酸盐的生成增加导致的。因此,UM5细胞中丙酮酸和其他TCA中间体的水平显著更高就可以理解了。我们的研究结果表明高侵入性头颈部癌细胞(UM5UM1)表现出比低侵入性头颈癌细胞(UM2UM6)更积极的代谢表型。

 使用高效离子色谱结合Q轨道离子阱HF质谱仪研究头部和颈部癌细胞的靶向代谢组学分析

Figure 6. CSCNSCC6种靶向代谢物的定量分析。 结果表明与NSCC相比,三种代谢物丙酮酸/柠檬酸/α-酮戊二酸在CSCs中增加,而延胡索酸,苹果酸和琥珀酸在CSC中降低。

CSCNSCC之间的六种代谢物的靶向分析结果(图6)证实了我们的结论。基于Cap IC-MS的非靶向代谢组学分析,在CSC中存在较高水平的丙酮酸盐,柠檬酸盐,顺式乌头酸盐,异柠檬酸盐和2-酮戊二酸盐,而当与非癌症干细胞(NCSCs)比较时,琥珀酸盐,延胡索酸盐和苹果酸盐显示逐渐降低的水平。在本研究中,使用靶向代谢组学分析观察到相似的结果,这表明非靶向和靶向IC-MS方法都可以定量癌细胞代谢组学分析。然而,这些代谢物在CSCsNSCC之间表达差异的原因仍有待进一步研究。

 

亮点

1.证明了基于高分辨率分离的IC,用于HR/AM测定的Q Exactive HF MS,以及使用稳定同位素标记的内标进行绝对定量的靶向代谢组学方法。该方法允许在分析运行中同时进行靶向和全代谢组学分析,并且提供了极大的优势,例如目标分子的高灵敏度,准确性和可重复性,以及细胞代谢物组的综合分析。

2. 该方法实现了6个目标代谢物的5个数量级的广泛动态范围。表明代谢表型在高和低侵入性头颈癌之间以及CSCs和非SCCs(非干细胞癌细胞)之间可以明显区分。

 

参考文献

Targeted Metabolomic Analysis of Head and Neck Cancer Cells Using High Performance Ion Chromatography Coupled with a Q Exactive HF Mass Spectrometer

  Analytical Chemistry (2016) IF=5.886

 

使用高效离子色谱结合Q轨道离子阱HF质谱仪研究头部和颈部癌细胞的靶向代谢组学分析

 

 

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