功能代谢组学阐述酵母生物合成调控

  研究背景  

  代谢调控在癌症，代谢疾病，病原体感染，微生物群落，热量限制以及推进老化过程中起关键作用。因此，保守的代谢调节器和传感器，包括雷帕霉素(TOR)途径的靶标，已经重新聚焦在医学和生物技术领域。但是，基因组规模的生物合成调控以及基因组和代谢之间的相互作用尚不明确。  

  氨基酸可以作为蛋白质合成的前体，也可以作为核苷酸，辅因子和脂质合成，碳氮传感和内稳态以及氧化还原缓冲的中间体。为了能够使功能性基因组学方法研究代谢，利用酿酒酵母基因组规模的基因敲除集合中的氨基酸营养缺陷型，通过靶标代谢组学来记录所有菌株的精确氨基酸浓度分布，并将获得的信息组装在基因组规模的基因-代谢相互作用中。通过描述在染色质水平上运作的转录和信号转导的代谢影响，或者通过代谢依赖系统，核糖体或蛋白质转运，通过稳态反馈，实现对细胞生长代谢的调节和稳态的全局洞察。

  材料与方法

  1.高通量氨基酸定量分析  

  代谢物提取：351个基因缺失的酵母菌株，在同一天对同一批次的菌株进行代谢物提取。  

  检测平台：Agilent 1290 Infinity-Agilent 6460；利用Masshunter软件以动态SRM模式获得游离氨基酸的信号。

  2.雷帕霉素敏感性分析  

  在SM培养基中的384多孔板(70ml/孔)中，0.1 OD600条件下接种11个浓度为7-1000nM(n=4)的雷帕霉素菌株，监测生长48h。测定最大比生长速率并用于确定剂量反应曲线中的EC50值。

  3.蛋白质印迹的可视化  

  将表达GFP-Atg8的营养缺陷型菌株在指数生长期间收集在SM培养基中，并在30℃接种于氮-星型浮选培养基SD(-N)中6h。收集OD600等分试样提取蛋白质，使用兔多克隆抗GFP和山羊抗兔的硝化纤维膜上的化学发光使GFP和GFP-Atg8显现Ig-HRP抗体。

  4.荧光显微镜  

  在SM培养基中指数生长期间收集细胞，在SD(-N)培养基中饥饿6h。图像在Olympus IX81宽视场显微镜和CoolSNAP HQ2 CCD照相机下采集。选择5?10片一幅图像Z-stack，计算并去除背景噪声，用“和切片”方法投影切片，并在ImageJ中调整亮度和对比度。

  主要研究结果 

  基因缺失影响生物合成代谢组

  图1.基因组-代谢组相互作用影响氨基酸生物合成代谢

  在不存在氨基酸补充物的情况下存活的4,913个基因缺失菌株在人工培养基中培养并生长至指数期，并通过靶标分析确定其氨基酸谱(图1A)。发现谷氨酰胺浓度最高，色氨酸浓度最低(图1B)。单个氨基酸的相对标准偏差为6％?34％(图1B)。平均氨基酸浓度对163个基因缺失敏感，丙氨酸最多(431)，对亮氨酸影响最不频繁(25)(图1C)。多元统计分析和单变量统计量共发现了1,519(32％)个基因显着影响(图1D)。

  另外发现，氨基酸特征是高度基因特异性的。455个图谱的特征是单一浓度变化，而只有378个(25%)具有两个以上的氨基酸变化(图1E)。作为特异性的极端情况，我们在缺乏线粒体甘氨酸脱羧酶亚基GCV1和GCV2的情况下检测到甘氨酸的全基因组独特积累等(图1F)。

  转录调控和蛋白质转运影响氨基酸代谢谱

  图2.染色质和细胞内运输增强代谢特征

  发现在转录，染色质生物学，翻译，蛋白质转运和线粒体生物学中起作用的基因是基因本体(GO)(图2A)的分析中大部分氨基酸浓度变化的原因。由于这些群体构成大的基因类别，基于存储在酵母属基因组数据库中的GO项关联基因组富集分析(GSEA)中的特定富集进行测试。6,806个GO功能分类中的523个被显着富集(校正p值<0.05)。根据重叠的基因连接条目，80个直接关联的GO条目被注释到代谢“扰动网络”中(图2A)。参与“翻译”，“蛋白质和囊泡运输”，“氨基酸生物合成”，“线粒体细胞”，“核糖体生物合成”和“转录/染色重塑“最频繁地改变代谢特征(图2B)。该网络揭示了氨基酸生物合成与染色质重塑的密切联系(图2B)。这与基因特异性转录因子(TFs)形成对比，这些转录因子在这个分析中没有被富集，而且在直接比较中产生更小的干扰(图2C和2D)。

  TORC1网络在指数增长时期主导代谢信号

  图3.氨基酸浓度与转录和转录后调控机制的基因组规模和基于遗传组分的相关性

  注：(A)根据生物合成前体进行颜色编码的氨基酸水平的相关性分析(如B所示)。(B)氨基酸生物合成途径，根据其碳主链的来源而着色。叠加的是明显改变浓度的调节突变体(校正P<0.01)。饼图表示TF，激酶和磷酸酶的相对贡献；大小按总数计算。(表S2)。(C)通过同时改变代谢物(校正p<0.01)定义的最广泛的代谢影响(R3)排列的转录和磷酸信号传导突变体。(D)富集分析的一般调控网络和细胞过程(GSEA)。

  缩写：PPP，戊糖磷酸途径；TCA，三羧酸循环；g6p，葡萄糖6-磷酸；3pt，3-磷酸甘油酯；3pg，3-磷酸甘油酸盐；pep，磷酸烯醇式丙酮酸盐；oaa，草酰乙酸；glo，乙醛酸盐；akg，α-酮戊二酸；三字母代码中的氨基酸；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，校正Benjamini-Hochberg(BH)。

  代谢特征将主导TORC1功能连接到内膜运输

  图4.指数生长过程中TORC1抑制的氨基酸特征反映了囊泡介导的转运中断

  用雷帕霉素处理酵母菌株，以药理学方式抑制TORC1并获得强烈改变的氨基酸特征谱，并将数据映射到基因组规模的数据，确定Dtco89数据非常相似(图4A)。揭示代谢特征是TORC1抑制的直接后果，雷帕霉素处理略微进一步改变了Dtco89菌株的谱图(图4B)。通过扰动TORC1激活蛋白来证实代谢效应，发现TOR上游激活剂的扰动模仿雷帕霉素和TCO89缺失的代谢特征，而抑制剂的缺失导致相反的代谢缺陷(图4B)。此外，利用代谢特征来识别下游过程的原因，发现主要TORC1效应器途径的代谢特征以及用环己烯酰胺抑制翻译与TORC1抑制的代谢特征不匹配(图4A和4C)。相反，蛋白质通过内膜系统转运所需的全套基因揭示了类似的代谢缺陷(图4D)。然而，整个基因组的其他过程不符合这些代谢变化，这意味着指数生长细胞中的TORC1功能通过其在内膜运输系统中的作用连接到氨基酸代谢。

  代谢特征提供正交功能基因组信息

  图5.氨基酸特征是关于基因功能的信息，并为其他分子网络提供正交信息

  由于没有用于评估新陈代谢的“金标准”数据集-驱动的基因注释，测试了关于蛋白质复合物(复杂富集分析工具[COMPLEAT])，低通量遗传和物理蛋白质-蛋白质相互作用，以及基因本体GO的数据集。根据基因对共聚类的概率(共识指数)进行排序，并进行精确召回分析(图5A)。为了说明该方法的潜力，将127个非必需核糖体基因聚类，并获得正确的亚基分配(图5B)。由于质疑功能代谢组学与现有的物理和遗传相互作用网络相比将提供何种程度的新信息，比较了代谢簇构建的图谱和存储在检索互动基因/蛋白质(STRING)和YeastNet数据库的全套功能基因组网络，发现代谢特征提供高度正交的信息，连通性的最大重叠是0.06(图5C)。硫辛酸(LA)生物合成途径的基础上，代谢特征为基础的关联和预先存在的功能基因组数据之间的关系。代谢途径，加上其与PDH复合物，需要硫辛酸作为辅因子，全面捕获他们的代谢组学特征（图5D和5E；表S3）。其他数据集完全捕获丙酮酸脱氢酶(PDH)复合物，尽管更全面，但很大程度上未能将其连接到LA途径(图5E和5F)。

  通过功能代谢组学关联基因功能

  图6.通过功能代谢组学关联基因功能

  通过稳健共识聚类，使用成对马氏距离和通过自适应分枝计算的最佳聚类来分析4,678个基因缺失菌株代谢概况。在获得的280个簇中(图6A；表S1)中，GO(74%)或KEGG(17%)的功能条目(图S4A)被富集。3,923个基因缺失株(83%)与功能条目有关。举例说明了在它们的代谢特征上捕获的10个不相关的细胞过程，并比较与物理和遗传相互作用数据的关联(图6B)。功能代谢组学通过染色质捕获转录调控，包括组蛋白甲基化(簇129)，脱乙酰化(簇70和134)和核小体重塑(簇156和222)等。另外，由于簇135含有对液泡融合和自噬都很重要的基因，对此进行了实验验证(图6C)。选取了与自噬相关的3个基因和3个不相关基因，利用蛋白印迹分析发现，除了Δtef4以外，检测到自噬缺乏症的一种特征表型，即在缺氮时GFP-Atg8的分裂受损(图6C，右)。此外，荧光显微镜显示液泡形态异常(图6C，右下)，GFP-Atg8向液泡腔的释放减少(图6C，底部)。其他高通量的研究加强了这些关联(图6C，左上)。

  总结  

  本文在酵母中提出了一个精确的、基因组规模的功能代谢组谱，并通过靶标分析精确捕获聚合细胞代谢的主要部分；氨基酸代谢体为指数生长的细胞内生物合成代谢的调控和稳态提供了系统的洞察。另外，生物合成代谢体对1500多个基因的协同作用十分敏感。在大多数情况下，它们的缺失会产生高度特异性的浓度特征，将代谢调控网络的主导作用归因于染色质水平的基因调控，以及蛋白质效应器。新陈代谢的基因组规模观点将调控网络与它们的主要效应器连接起来，其指数增长下的主要代谢影响与囊泡介导的转运有关。因此，功能代谢组学在功能基因注释方面具有很高的潜力。通过提供关于现有物理和遗传相互作用网络的正交信息，这些基于表型的关联对于注释至今仍未被识别的基因尤其有效。因此，到目前为止，有一半以上的酵母菌基因，其中许多在其他物种中拥有同源基因(甚至人类)，在它们的基因标签上被认为是一种功能关联。

  点击原文链接：http：/dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.09.007查看论文全文