PacBio三代全长测序揭示玉米转录组的复杂性

  研究背景：

  玉米（Zea mays）是全球重要的农作物，也是研究转录组代谢通路的重要遗传模型。玉米基因组于2009年公布，后续利用EST和RNA-Seq数据进行补充注释。然而RNA-Seq中，短读长无法提供转录本全长序列，限制鉴定可变剪接形式。本文用PacBio长读长测序技术，对玉米自交系B73的六个组织（根、幼雌穗、幼雄穗、花粉、胚芽、胚乳）进行全长转录组测序分析，发现57%的转录本是新转录本。玉米基因表达比以往预期的更复杂。

  研究方法：

  材料：

  取玉米自交系B73不同发育阶段的6个组织（根、幼雌穗、幼雄穗、花粉、胚芽、胚乳）。

  研究方法：

  1、提取6个组织的mRNA。根据Barcode建库方案，每种组织来源的RNAs在反转录为cDNA的时候被引入一种特定序列的Barcode，混合后通过片段化筛选，构建6种插入片段文库（＜1, 1-2, 2-3, 3-5, 4-6, ＞5kb）。上机，用47个SMRT Cell，在PacBio RS II平台进行全长转录组测序。

  2、对6个组织进行二代RNA-Seq测序，每个样品三个重复。

  3、通过已发表的甲基化数据，对isoform，lncRNA 和 non-lncRNA区域进行甲基化分析。

  测序策略和分析流程：

  测序：PacBio Iso-Seq； Illumina HiSeq 2000、PE 101bp。

  分析：比对软件：TopHat2、STAR、GMAP；拼接软件：cufflinks2、trinity

  异构体与现有注释基因比对：cuffcompare；ORF预测：EMBOSS

  结果：

  1、PacBio和RefGen_v3异构体比较

  实验发现了111151种独特的转录异构体，对应大约27000个基因。这个数量接近参考基因组注释中转录本数量的两倍。其中3%的异构体来源于全新基因位点的全新转录本。57%的异构体来自于已有的注释基因的全新转录本。

  2、全基因组水平不同数据的CIRCOS可视化

  A、玉米基因组的染色体组型

  B、比对到RefGen_v3和PacBio数据库的基因密度比较（上圈：RefGen_v3，下圈：PacBio Iso-seq），RefGen_v3基因密度更高。

  C、RefGen_v3和PacBio数据库的亚种密度比较（上圈：RefGen_v3，下圈：PacBio Iso-seq），PacBio Iso-seq密度更高。

  D、CG甲基化水平

  E、CHG甲基化水平

  F、CHH甲基化水平

  G、基因组重复密度

  H、lncRNA密度（lncRNA在着丝粒区域外较丰富，且和低重复率和低CG/CHG甲基化区域有关。）

  I、融合转录本的连锁（紫色：染色体内；暗黄色：染色体间）。更倾向于在染色体间发生，且倾向于在染色体末端发生。

  3、组织特异性异构体和选择性剪接模式

  在6个组织中，花粉的组织特异性的异构体比例更高（9842；61.3%），其次是胚芽（20050；49.2%）、胚乳（12392；46.7%）。根最低（13386；44.6%）。

  用AStalavista软件分析五种主要的可变剪接类型（内含子保留、外显子跳跃、3’端可变剪接、5’端可变剪接、互斥外显子）。主要是内含子保留（40%），其次是3’端可变剪接（19%），外显子跳跃最少（7.8%）。互斥外显子剪接主要集中在胚乳。

  4、lncRNA鉴定

  本次分析得到了878个LncRNA，其中11个是已有研究确定的， 另外867个是新发现的LncRNA（平均读长为1.1kb）。

  5、PacBio异构体的验证

  A、PacBio得到的约86%剪接位点也在短读长数据比对到。

  B、比较组织间的剪接类型。

  C、之前报道的错误注释的RGH3基因在全长转录组序列中发现。

  D、之前未发现的CSR1基因在全长转录组序列中发现。

  6、剪接位点的DNA甲基化水平

  A、DNA甲基化水平，结合正义链、反义链。

  B、正义链的DNA甲基化水平。

  C、反义链的DNA甲基化水平。

  D、只有一个异构体基因的DNA甲基化水平。

  E、有两个至十个异构体基因的DNA甲基化水平。

  F、超过20个异构体基因的DNA甲基化水平。

  亮点分析：

  1、用Illumina的HiSeq 2000平台上测序重复样本的RNA，验证和量化PacBio产生的转录本isoform。对于PacBio数据，6种组织中平均86%的剪接位点获得短读长测序的支持。

  2、长片段的转录组数据也帮助修复不正确的基因模型。

  3、DNA甲基化似乎在isoform生成中发挥作用。选择性剪接被受体位点CHG甲基化所抑制，但被供体位点CG甲基化所促进。

  参考文献：

  Bo Wang, Elizabeth Tseng, Michael Regulski, Tyson A. Clark, Ting Hon, et al.

  Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing.

  NATURE COMMUNICATIONS. 2016, IF= 11.329