猕猴桃黄酮生物合成相关代谢与转录的联合分析

  研究背景  

  为了评价代谢物的变化与果实颜色变化之间的相互关系，本研究对两种不同猕猴桃的果肉进行了代谢物和转录本的组合分析。选取了果实发育的两个不同阶段：70d(盛开后)和100d(盛开后)以及两个品种“HB”和“YF”。采用超高效液相色谱四极串联质谱法和高通量RNA测序法分别获得代谢物和转录谱。对代谢物的鉴定和定量结果表明，共获得28,837种代谢物，其中13,715种能够匹配到物质。通过对HB100与HB70的比较，发现41个代谢产物为黄酮类化合物，其中7个为差异代谢物，分别为苯并呋喃酮、木犀草素、二氢杨梅素、矢车菊素、天竺葵色素，飞燕草色素和(?)-表没食子儿茶素。代谢物与转录本的关联分析表明，在果实发育过程中，两种代谢途径存在显着差异，其中之一是类黄酮生物合成，选择14个结构基因进行表达分析，同样转录组分析得到5个转录因子基因。RT-qPCR结果和聚类分析表明，AaF3H、AaLDOX、AaUFGT、AaMYB、AabHLH和AaHB2最有可能成为候选基因。建立了类黄酮生物合成的调节网络，以说明参与代谢物积累的差异表达的候选基因具有显着差异，在果实发育期间诱导红色着色。这种连接基因和类黄酮的调节网络揭示了一个系统参与了红果肉和绿果肉的色素沉积，表明这种结合分析方法这不仅有助于了解基因型与表型的关系，而且为育种提供更有价值的信息。

  材料方法

  材料  

  两种不同类型的猕猴桃：“HB”(全红色果肉)和“YF”(全绿色果肉)；  

  两种不同发育阶段：开花后70d和开花后100d；  

  每个样本设置三个生物重复，每个样本从6个猕猴桃树中随机采集30个果实，每两个作为一个生物重复。

  代谢组 

  甲醇水(体积比为1:1)提取液；在提取和后续分析过程中，分别进行3次独立重复。  

  检测平台：UPLC-TripleTOF5600plus  

  分析软件：采用XCMS软件3.2.0(UC，Berkeley，CA，USA)对色谱和质谱进行控制；MSConvert用于LC-MS原始数据转换成mzXML格式；metaX软件用于差异代谢物的筛选和定量分析；  

  数据库注释：PLANTCYC、KEGG、in-house、HMDB； 

  转录组 

  检测平台：Illumina Hiseq  

  利用iTAK软件预测转录因子，p-valve<0.05作为差异基因的筛选标准。

  主要研究结果  

  1.代谢物鉴定

  图1 两种不同品种不同发育阶段的猕猴桃表型

  本实验通过LC-MS对两个品种的猕猴桃的不同的时期进行检测(图1)。正离子模式检测到18,598个物质，其中定性出9,016个物质，通过二级谱图鉴定的物质有1267个，通过一级谱图的数据库(Plantcyc)鉴定的有3612个，在KEGG数据库中能够注释到的物质有8070个。负离子模式检测到到10,239个物质，其中能定性出4,699个物质，通过二级谱图鉴定的物质有360个，通过一级谱图的数据库鉴定的有1968个，在KEGG数据库中能够注释到的物质有4321个。能注释到的8,070个物质(正离子模式)和4,321个物质(负离子模式)分别注释到18个代谢途径中。其中有3580个代谢物(正离子模式)和2461个代谢物(负离子模式)分别注释到代谢途径中，分别为“其他次生代谢物的生物合成”，“萜类和聚酮化合物的代谢”，“氨基酸代谢”，“辅因子和维生素的代谢”以及“碳水化合物代谢”(图2)。其中480个物质(正离子模式)和340个物质(负离子模式)被注释到其他次生代谢物的生物合成。除此之外，有73个代谢物(正离子模式)和67个代谢物(负离子模式)参与了类黄酮和花青素合成途径(图3)。

  图2 代谢物KEGG通路注释

  图3 已鉴定的代谢物被注释到的前50条KEGG途径

  从二级质谱鉴定中获得的所有1267和360种代谢物都被分配到HDMB数据库中，其中在POS和NEG中的550和250种代谢物被划分为11个HDMB二级分类。其中305种代谢物被列入“有机酸和衍生物”一类，占POS模式中所有类别的大多数。同时，“有机酸和衍生物”是第一大类，含有59种代谢物，其次是NEG模式中的“有机氧化合物”和“脂质和类脂分子”(图4)。

  图4 已鉴定的代谢物被注释到11个HMDB二级分类

  2.转录组测序

  转录组测序的结果分析到2614个转录因子相关的基因，这些转录因子来自于80个转录因子家族。其中最主要的转录因子家族为：AP2/EREBP、MYB、C2H2、C3H、Orphans、NAC、bHLH、WRKY、HB(图5)。同时，在这2614个转录因子中有7个基因是与类黄酮生物合成相关。这7个基因分别为：c88340_g1、c105731_g1、c18002_g1(AaMYBC1)、c102250_g1(AaMYB)、c86342_g1(AabHLH)、c127253_g1(AaHB1)、c129627_g1(AaHB2)。这7个基因主要来源于MYB(参与植物苯丙烷类次生代谢途径的调节)、bHLH(参与植物生长发育、参与植物适应缺铁或其他非生物胁迫逆境反应)、HB(参与植物生长、光信号、植物逆境胁迫等过程)三个家族。

  图5 前20个转录因子家族的转录因子数目

  3.代谢与转录的联合分析

  将转录组的数据与代谢组的数据进行相关性分析。分析结果显示：HB100 vs HB70有646个差异代谢物，差异代谢途径有13种；YF100 vs YF70有156个差异代谢物，差异代谢途径有18种；HB100 vs YF100有484个差异代谢物，差异代谢途径有12种。类黄酮合成途径和半乳糖代谢途径在3个差异代谢组中都有变化。同时，通过转录组数据分析，发现有8个类黄酮合成相关的基因发生改变(图6)。

  图6 差异基因的鉴定

  挑取了20个类黄酮合成相关的基因(14个结构基因，5个调控基因)对转录组的数据进行进一步验证如图7。结果显示：结构基因中AaF3H，AaLDOX、AaUFGT 3个基因，调控基因中AaMYB、AaHB2 2个基因在HB100中明显高于HB70、HB100。聚类结果显示AaF3H、AaLDOX、AaUFGT、AaMYB、,AabKLH、AaHB2，6个基因聚成一簇(如图8)。此外，将AaMYB和其他物质中的MYB序列进行比对，得到相应的系统进化树。进化树结果显示AaMYB与CsMYB5a(茶树中MYB5a转录因子家族)可以聚类在同一个簇(图9)。

  图7 类黄酮合成相关的结构基因和调控基因的相对表达量

  图8 结构和调控基因的聚类分析

  图9 不同物种中40个MYB转录因子基因的系统发育分析

  4.黄酮类化合物生物合成调控网络

  为了更好的将类黄酮合成途径中的代谢物与基因等数据直观的展现出来，将上述结果中的基因与代谢物整合在一起构建了一张类黄酮代谢的网络图如图10。qPCR挑选的14个结构基因中，AaF3H，AaLDOX和AaUFGT相比于其他11个结构基因，在HB100样本中高于HB70。类黄酮合成途径中的苯并呋喃酮、木樨草素、二氢杨梅素、矢车菊素、天竺葵色素、飞燕草色素、儿茶素在HB100和HB70中有明显的差异。而导致这7个代谢物差异积累的原因可能是通过AaMYB、AabKLH、AaHB2这3个转录因子分别作用于AaF3H、AaLDOX、AaUFGT三个基因的启动子区域。除此之外，AaMYB，AabHLH、AaHB2、AaF3H、AaLDOX、AaUFGT几个基因也可以作为揭示猕猴桃红果肉形成机制的候选基因，为后期的猕猴桃红果肉的研究奠定了一定的基础。

  图10 HB100和HB70两个发育阶段中黄酮类生物合成的调控网络

  总结

  本研究通过转录组测序及代谢组分析，建立了类黄酮生物合成的调节网络，以说明参与代谢物积累的差异表达的候选基因具有显着差异，在果实发育期间诱导红色着色。这种连接基因和类黄酮的调节网络揭示了一个系统参与了红果肉和绿果肉的色素沉积，表明这种结合分析方法这不仅有助于了解基因型与表型的关系，而且为育种提供更有价值的信息。

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