全基因组层面综合分析与自闭症相关的microRNA

  摘要：

  遗传变异会导致自闭症谱系障碍（ASD）的风险已经确定，但转录后机制在ASD的作用还不是很清楚。我们测了ASD患者和正常人（对照）尸检获取的脑组织的全基因组的microRNA（miRNA）表达谱，鉴定参与影响ASD的miRNA和共调控模块。受到ASD影响的microRNA能够影响几百个不同基因的表达，其中有很大一部分是已经被发现的自闭症风险基因。我们证实了其中几个miRNA及其靶基因对人类神经细胞可能的调控关系。包括hsa-miR-21-3p，一种具有未知中枢神经系统功能的miRNA，在ASD中上调，调节目标神经元基因的表达下调。hsa_can_1002-m，一种先前未知的，在灵长类动物中特异性存在的miRNA，在ASD中下调，调节与神经系统的发育和免疫功能相关的表皮生长因子受体和成纤维细胞生长因子受体信号通路。研究结果支持miRNA失调在ASD病理生理学的作用，并为未来对神经精神疾病中miRNAs的分析提供了丰富的数据和框架。

  材料：脑组织样本。

  取材方法：尸检获得的脑组织，包括：额皮质、颞叶皮质、小脑蚓部。

  RNA提取：总RNA提取：miRNeasy kit (Qiagen)；RNA完整性：Agilent Bioanalyzer；rRNA的分离：Ribo-Zero Gold kit (Illumina)；

  测序：Illumina Hiseq 2500，SE 50bp；

  分析：去除接头序列：FASTX-Toolkit；测序质量评估：FastQC v0.10.1；与hg19（人参考基因组）比对：miRDeep2 package；预测成熟miRNA：miRanalyzer；差异表达分析：DESeq R package；FDR评估：Benjamini-Hochberg correction；miRNA靶基因预测：TargetScan；GO富集分析：GO-Elite (version 1.2.5)；蛋白互作（PPI）分析：DAPPLE v2.0。

  研究结果：

  1、ASD大脑中差异表达的miRNAs

  B、95个皮质样本中差异表达的miRNA。（17个显著下调、41个显著上调）

  C、颞叶皮质和额皮质中差异表达的miRNAs，r=0.96，高度一致。

  灰线：差异表达的miRNAs在颞叶皮质和额皮质的回归线。

  D、95个皮质样本中，差异表达最显著的miRNAs的层次聚类。

  基于：诊断、年龄、性别、皮质区域、癫痫发病率、精神病药物、RIN、样品来源，其它因素并未驱动聚类。热图显示用于聚类的miRNAs表达量。大多数ASD样本中，miRNAs失调。qRT-PCR实验验证了十个差异表达的miRNAs。

  2、ASD大脑中miRNA共表达模块的失调

  A、109个皮质样本中miRNA的加权基因共表达网络分析（WGCNA）。

  确定了11个模块，箭头表示与ASD显著相关的三个模块（棕、紫红、黄色）。

  B-D、各模块的特征基因及不同协变量之间的皮尔逊相关系数。（B、109个皮质样本；C、年龄介于15-30的；D、年龄大于30的）

  E-J、显著相关模块的特征基因值及网络图。样品根据性别和颜色编码分块。

  3、miRNA的靶基因中富集ASD风险基因

  A、受自闭症基因、智障基因、智力缺陷蛋白的基因、突触后致密区基因、优先在胚胎大脑表达的基因、编码染色质修饰的基因影响的热图。

  B、受变异（包括可能的基因突变、错义突变、同义突变、复发突变）影响的基因热图。

  C、来源于AGRE和PGC两个机构的ASD、阿尔茨海默病、精神分裂症影响的基因热图。

  D、人大脑皮质发育过程影响的基因热图。

  4、miRNA和mRNA表达变化的关系

  A-C、差异表达、上调、下调的miRNA和mRNA的主成分分析。

  D、与ASD最显著相关的miRNA模块及其预测的靶mRNA模块的负相关性。

  全基因组层面综合分析与自闭症相关的microRNA

  A、ASD影响的mRNAs及与ASD最显著相关的miRNA模块对应的mRNA模块。

  B、 ASD分子病理中miRNA的失调作用模型。上调的miRNAs及模块可能促进ASD中风险基因和神经元基因下调。下调的可能有助于ASD中免疫基因的上调。

  C-D、受ASD影响最强的及最保守的miRNA的靶基因。

  5、hsa-miR-21-3p调控ASD中神经元基因的下调

  A、人神经前体细胞中，hsa-miR-21-3p过表达引起的mRNA的分布及累计分布。预测的hsa-miR-21-3p的靶基因下调。

  B-D、验证的hsa-miR-21-3p调控的ASD相关基因的热图。

  E、ASD影响的mRNA及模块。

  F、hsa-miR-21-3p调控的ASD的部分相关基因。（hsa-miR-21-3p过表达引起一些基因的下调，如PAFAH1B1-与神经元迁移密切相关、DLGAP1-结合自闭症风险基因的支架蛋白、ATP2B1-钙转运蛋白。）

  6、hsa_can_1002-m（灵长类特异性基因）调控EGFR和FGFR通路中的目标基因

  A、人神经前体细胞中，hsa_can_1002-m过表达引起的mRNA的分布及累计分布。预测的hsa_can_1002-m的靶基因下调。

  B、qRT-PCR分析人、黑猩猩、猕猴、小鼠中的hsa_can_1002-m，RNU6-2是对照。

  C、hsa_can_1002-m靶基因的GO富集。EGFR（表皮生长因子受体）和FGFR（成纤维细胞生长因子）通路，与神经元和神经胶质细胞的增殖、分化以及炎症免疫有关。hsa_can_1002-m下调将增加通路活性。

  D、验证的hsa_can_1002-m靶基因的蛋白质-蛋白质互作网络。

  E、hsa_can_1002-m调控的ASD的部分相关基因。

  7、其他候选miRNA的实验表征

  A-C、人神经前体细胞中，hsa-mir-103a-3p，hsa-mir-143-3p和hsa-mir-23a-3p过表达引起的mRNA的分布及累计分布

  D、hsa-mir-103a-3p，hsa-mir-143-3p下调的靶mRNA的富集。

  E、验证的hsa-miR-23a-3p调控的ASD相关基因的热图。

  F、验证的部分相关基因列表。

  亮点分析：

  1、全基因组层面综合分析了ASD中miRNA的功能。通过整合几个ASD的候选基因集，并与mRNA表达数据联合分析，通过多个证据表明miRNA失调在ASD中的功能。

  2、这些分析为未来的研究确定了一组丰富的ASD相关的候选miRNA。

  参考文献：

  Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder.

  Nature neuroscience. 2016, IF= 16.724