基于iTRAQ的蛋白质组学和RNA序列分析揭示一个调控石榴果皮颜色的复杂网络

  果皮颜色是影响石榴果实商品性的重要因素。因此，阐明果皮颜色发育的遗传机制，可为提高果皮颜色的石榴品种选育提供参考。在本研究中，基于iTRAQ的蛋白质组水平分析与基于RNA序列的转录组水平分析相结合，以检测与果皮颜色发育相关的蛋白质和基因。分析了“Tunisia”(红色水果)和“White”(白色水果)石榴品种在果实发育的两个阶段。在蛋白质组学和转录组学中，共鉴定出27个差异丰富的蛋白质(增加的丰度)和54个不同表达的基因(16个上调，38个下调)。所鉴定的蛋白质和基因参与了花青素、二苯乙烯类、二芳基庚烷类、姜醇类、蚕豆类和苯丙素的生物合成，从而促进了石榴果皮颜色的形成。几种候选蛋白和基因与石榴果皮颜色有关的化合物和色素的一般反应(PAL；4CL；DFR；LDOX/ANS；CHS；and F3′5′H)和糖基化(GT1 and UGAT)相关的酶对应。互补蛋白质和转录组水平分析揭示了控制果皮颜色的复杂分子网络。本研究筛选出的候选基因可为石榴新品种的标记育种提供参考。

  材料与方法

  材料：“Tunisia”(TP，红色果皮)和“White”(SP，白色果皮)石榴，在果实着色和成熟期收集果皮，3个生物学重复 

  方法：SPSS分析；iTRAQ；LC-MS/MS分析；RNA-seq分析；qPCR验证  

  测序平台：HiSeq2000，PE100  

  生信分析：蛋白质的鉴定和量化：Mascot 2.3.02；IQuant程序识别蛋白质；Mascot软件包报告峰面积自动选择多肽；SOAPnuke筛选测序数据；HISAT比对到参考基因组序列；TEREAD用于组装成转录本；使用Cufinks的参考基因模型进行比较；用RSEM对基因表达进行定量；Cufdif确定P值的阈值；利用KOBAS2.0网站对DAP或DEGS进行了KEGG途径富集分析

  结果分析

  1、基于iTRAQ技术的DAP识别  

  采用iTRAQ和LC-MS/MS分析方法，对果实着色期(SP1_TP1)和成熟期(SP2_TP2)两组DAP进行鉴定和定量。

  Fig.1 不同比较中鉴定的石榴果皮中差异表达的基因和蛋白质

  在这些蛋白中，SP1_TP1和SP2_TP2中分别有888和1,969 DAPs。在SP1_TP1的比较中，与SP1相比，在TP1中，482个DAPs上调，比SP1丰富；406个DAPs下调，比SP1少。同样，在SP2_TP2的比较中，在TP2中，1，016个DAPs上调，比SP2丰富，953个DAPs下调，比在SP2中少。SP2_TP2的DAP几乎是SP1_TP1的两倍。这些结果表明，许多蛋白质在两个果实发育阶段表现出不同的丰度，第二个分析阶段的DAP较多。

  2、DEGs的转录分析

  在两个石榴品种的果实发育过程中，许多基因在两个果实发育阶段之间有不同程度的表达，在果实成熟期表达较多。

  表1 从ITRAQ和RNA测序数据中检测蛋白质和转录物

  3、蛋白质丰度与基因表达水平的比较分析  

  为了评估转录水平与蛋白质丰富度之间的关系，比较分析了两个水果品种的发育阶段的DAPs和DEGs。

  Fig.2 蛋白质丰度和基因表达水平的不同比较.(A)蛋白质和基因的Venn图。(B)不同群体之间共同的DAP和DEG的变化。(C)比较DEGS和DAP转录本和蛋白质水平的变化。(D)SP1_TP1中DEGS和DAP的转录水平与蛋白质丰度的相关性。(E)SP2_TP2中DEGS和DAP的转录水平与蛋白质丰度的相关性。

  在比较SP1_TP1和SP2_TP2的过程中，共识别出552个共有DAPs和1684个共有DEGs。在共有的DAP中，SP1_TP1比SP2_TP2更丰富。此外，在SP1_TP1和SP2_TP2中分别鉴定出184和478个DAPs及其相应的DEGs。转录水平与蛋白质丰度之间存在较大差异，SP1_TP1和SP2_TP2中DEGs均多于DAPs。为了分析果皮颜色发育过程中转录和蛋白质组学变化的一致性，利用DAPs和DEG的定量数据进行了相关分析。Pearson相关性检验表明，DAP中的倍数变化显著（P<0.001）与相应DEG的倍数变化负相关（分别在SP1_TP1和SP2_TP2中rpearson = -0.29和-0.23）。因此，转录水平与蛋白质丰富度的相关性较差。

  4、DAPs和DEGs的KEGG通路注释  

  为了注释基因和蛋白质的功能，利用KEGG数据库对SP1_TP1和SP2_TP2中的DAP和DEGS进行了途径富集分析。

  Fig.3 在（A）SP1_TP1和（B）SP2_TP2中与差异表达基因和差异蛋白相关的KEGG途径。左和右分别表示与通路相关的蛋白质数量和基因数量。

  在SP1_TP1中，521条DAP在11条通路中显著富集(校正P值<0.05)，3，181条DAP在30条通路中显著富集(校正P值<0.05)。SP1_TP1中的DAP和DEGS均富集了以下途径：花青素生物合成；二苯乙烯类、二芳基庚烷类和银杏醇生物合成；光合作用；苯丙氨酸代谢；类黄酮生物合成；类苯丙烷生物合成；次生代谢产物的生物合成；代谢途径。

  在SP2_TP2中，630个DAP在14条途径中显著富集，2，936个DAP在22条途径中显著富集。SP2_TP2中的DAP和DEGS共有以下几种途径：花青素生物合成；二苯乙烯类、二芳基庚烷类和银杏醇生物合成；光合作用；蚕豆类生物合成；α-li 非烯酸代谢；过氧化物酶体和苯丙酸类生物合成。

  另一项比较分析表明，四种途径(即花青素生物合成；二苯乙烯类、二芳基庚烷类和银杏醇生物合成；类蚕豆类生物合成；苯基丙氨酸b) 在SP1_TP1和SP2_TP2之间普遍存在。因此，进一步研究这4个途径作为石榴果皮色素发育的候选途径。

  5、与候选通路相关的DAPs和DEGs的鉴定

  在SP1_TP1和SP2_TP2之间发生双调控的DAPs和DEGs，随着丰度的增加，27个DAPs和54个DEGs(16个上调DEGs和38个下调DEGs)被注释为参与花青素生物合成；苯乙烯类、二芳基庚酸类和姜酚生物合成；类黄酮生物合成和类苯丙烷生物合成。

  Fig.4 在每个途径中（A）差异丰富蛋白质（DAP）和（C）差异表达基因（DEG）的数量的总结.（B）DAP的注释和丰度变化.（D）DEG的注释和表达水平变化.数字代表基因和蛋白质的数量. 

  表2.TP1_SP1和TP2_SP2的比较中‘Tunisia’和‘White’石榴品种之间的候选差异丰富蛋白(DAP)的相关通路

  进一步分析表明，在果实颜色发育过程中，蚕豆类和苯丙类生物合成酶的丰度增加，而相应基因的表达水平下降。

  6、候选DAPs和DEGs的路径分析  

  通过路径分析，更全面地描述了候选DAPs和DEGs的功能。

  Fig.5 石榴果皮中与花青素生物合成相关的差异丰富蛋白(DAPs)和差异表达基因(DEGs)。关键酶的数字和缩写分别以红色和蓝色文本显示。

  共有13个DAPs和17个DEGs与花青素生物合成相关的酶相对应。包括苯丙氨酸氨裂解酶(PAL，三种蛋白)，4-香豆酸-CoA连接酶(4CL，一种蛋白和一个转录本)，dihydrofavonol 4-reductase(DFR，一种蛋白)，白花青素双加氧酶/花青素合成酶(LDOX/ANS，一个转录本)、查耳酮合酶(CHS，一个蛋白和两个转录本)，favanone 3′5′hydroxylase(F3′5′H，两种蛋白和一个转录本)，(EC:1.1.1.234)(一个转录本)，(EC:1.14.11.23)(三个蛋白和三个转录本)，[EC:1.14.13.21](三个转录本)，[EC:1.17.1.3](两个转录本)，GT1(两个蛋白质和一个转录本)，UGAT(两个转录本)。这些基因和蛋白质是花青素生物合成中的核心酶，对石榴果皮颜色的发育起重要作用。

  7、基因表达水平的验证  

  采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测Gglean009951.1、Gglean020650.1、Gglean015001.1、Gglean015003.1等12个基因的表达水平。 

  qRT-PCR检测到的Gglean009951.1、Gglean020650.1、Gglean015001.1、Gglean015003.1表达趋势与iTRAQ分析检测到的编码蛋白丰度变化不一致。这些结果表明，深度测序是分析石榴基因表达水平及其相应蛋白丰度的一种准确、有效的方法。

  结论  

  1、综合定量蛋白质组学和转录组学分析表明，SP1_TP1和SP2_TP2中的DEGS比DAP多，只有少数DGS编码DAP。 

  2、转录水平的变化趋势与蛋白质丰度的趋势不一致。这些结果可能表明蛋白质丰度是由翻译后修饰和细胞剪接事件决定的，而不是基因转录水平的变化。  

  3、研究结果表明，iTRAQ和转录水平分析是一种互补的方法，可以用来表达特定生理过程的候选蛋白，包括石榴果皮颜色的发育。

  参考文献：Complementary iTRAQ-based proteomic and RNA sequencingbased transcriptomic analyses reveal a complex network regulating pomegranate (Punica granatum L.) fruit peel colour [J].Scientific Reports，IF=4.122