BSR策略对小麦抗白粉病QTL定位

  摘要  

  白粉病抗病基因Pm4b来源于波斯小麦（AABB），是一种有效的抵抗小麦白粉病菌的基因。在分子辅助育种的工作中，缺少和该基因紧密连锁的分子标记。本文利用转录组测序结合集群分离分析（BSR）技术对VPM1/7（NIL） x Bainong 3217 F2:3家系（237个）进行Pm4b的定位并开发紧密连锁分子标记。抗病、感病RNA混池分别获得20.7Mb/25.8Mb高质量read pairs，其中80%都是单独比对到小麦基因组草图上的，混池间的SNP和indel共有283,866个。和白粉病相关性最高的SNPs定位在2AL，其中84个变异位点是和抗病性状相关的，46个几种在2AL染色体远端的25Mb范围内，其中有4个SNP是和Pm4b连锁的。通过这些SNP在中国春基因组上的定位结果，设计了98对SSR（Pm4b附近）。其中3对标记被添加到新的遗传图中，将Pm4b定位到3cM遗传距离（对应6.7Mb区间）。该区间和短柄草5号染色体、水稻4号染色体、高粱6号染色体间存在共线性关系。其中预测出7个和抗病相关的基因，包括C2结构域蛋白、过氧化物酶酶活性蛋白、PKc类家族蛋白激酶、Mlo家族蛋白、丝氨酸/苏氨酸催化结构域。

  材料方法  

  VPM1/7?Bainong 3217 F4 × Bainong3217 F2:3家系(237个)，各挑选50个纯合抗、感材料混池。测序方案：Illumina HiSeq 4000，抗池（22.7M raw read pairs），感池)25.8M raw read pairs)，基因组：中国春组装结果（IWGSC WGS v1），比对参考基因组：STAR v2.5.1b，SNP/indel鉴定：GATK v3.6，关联分析：SNP深度≥6，AFD（等位基因频率变化）>0.6，p<1e-8，遗传图QTL定位：Mapmaker/Exp Version 3.0b，LOD阈值：3，标记最大遗传距离：50cM。

  研究结果

  1、近等基因系抗病基因遗传特点分析

  卡方检验结果表明在F2和F2:3群体中均符合单显性基因遗传。

  2、白粉病抗病基因定位结果

  注：A.全基因组范围内关联到的候选SNP（84个），其中46个集中在2AL（25Mb区间内）B. 2AL区间BSR关联分析结果AFD>0.6，p<1e-8；C.关联区域内4个SNP+开发的SSR标记+之前报道的该区域标记构建区间遗传图。

  2AL43, 2AL83, 2AL71, 2AL122四个和Pm4b连锁的标记sanger测序验证

  SNP标记基因型，对应16个F2:3家系材料表型，将Pm4b定位到2AL122之后。表明连锁的SNP都在候选基因的一侧，利用2AL122在中国春2AL物理位置之后的信息开发SSR标记。

  开发的SSR（上：Xics13，下：Xics43）在F2:3群体中扩增结果

  注：M：marker（D2000），1：NIL，2：Bainong3217，3-7：纯合抗病，8-12：纯合感病，13-17：杂合体。

  结合该区域之前公布的标记，新开发的该区间的SNP和SSR标记构建区间图谱，并将Pm4b定位区间进一步缩小至Xics13~Xics43之间。

  3、白粉病抗病基因物理位置及比较基因组学分析

  注：A. Pm4b在染色体上的物理位置；B.区间遗传图；C.定位区间中国春基因组功能基因排序；D/E/F：短柄草，水稻，高粱间共线性分析（红色：抗病相关基因，浅蓝：共线性基因，亮蓝：非共线性基因）。

  共线性区间内注释到7个可能与抗病相关的候选基因

  4、连锁标记在MAS中的验证应用

  连锁标记Xics13/Xics43在其他材料或已知抗白粉病材料（27种）中扩增结果表明：只有在NIL中能扩增出目标条带，表明这两个标记是和Pm4b紧密连锁的；在其他46份材料中只有Lankaoaizao 8能得到与NIL相同的条带。说明这两个与Pm4b紧密连锁的分子标记可以运用到MAS过程中。

  研究亮点  

  本文利用转录组测序结合集群分离分析（BSR）技术对VPM1/7（NIL） x Bainong 3217 F2:3家系（237个）进行Pm4b的定位并开发紧密连锁分子标记，通过开发基因组上的SSR标记将Pm4b的定位区间进一步缩小。通过分析该区域对应小麦基因组—中国春的序列和短柄草、水稻、高粱之间的共线性关系鉴定出该区间存在的7个与抗病相关的基因。并且针对多个品种的小麦进行两个连锁标记Xics13/Xics43的扩增，结果表明这两个分子标记是与Pm4b紧密连锁的，并且能够应用到MAS中。

  参考文献  

  Development of Molecular Markers Linked to Powdery Mildew Resistance Gene Pm4b by Combining SNP Discovery from Transcriptome Sequencing Data with Bulked Segregant Analysis (BSR-Seq) in Wheat . Frontiers in Plant Science, 2018. IF=4.291.