木薯响应冷/干旱胁迫下的lncRNA全面识别和功能预测

  摘要

  冷胁迫和干旱胁迫是影响木薯生长和产量的重要因素。当前LncRNA在哺乳动物和植物中已经被认作为是多种细胞过程的重要调控因子。目前针对木薯非生物胁迫下LncRNA的系统筛选和调节作用还并未有相关报道。本研究针对甘薯的幼芽和幼嫩叶片在冷胁迫、干旱胁迫以及空白对照处理下，比较分析了链特异性RNA-seq数据，最终获得了682个高置信度的LncRNA。其中16个LncRNA推测与甘薯已知的miRNA能靶向结合。此外通过分析small RNA-seq数据发现42个LncNATs（长链非编码天然反义转录本）和sense gene pairs（基因正义链）能形成nat-siRNA（天然反义小干扰RNA）。鉴定到318个响应冷胁迫或干旱胁迫的LncRNA，这些LncRNA与相邻基因共表达分析表现出一致或不一致。反式调控网络分析结果表明许多LncRNA是和激素信号转导、次生代谢产物合成以及糖代谢通路相关的。

  材料方法  

  木薯品种：TMS60444，切成1.5cm带有一个芽的茎种在盘中，温室中生长两个星期（温度26± 2°C，光照16h，黑暗8h），生长至5cm高（2-3片叶），转移至4°C处理；（处理1,6,12,24,48,72h后）分别收集芽的顶端和最幼嫩的叶片；20% PEG6000处理幼苗（1,3,6,12,24,48h）；对照材料均取相同时间，每个时间点和处理均取3个生物学重复。  

  测序样品：冷胁迫（24h），干旱胁迫（6h），空白对照，各3重复。 

  测序平台：HiSeq 2500 PE125，去rRNA建库；比对参考基因组：Tophat 2.0，reads组装：Cufinks，LncRNA注释：去除比对到编码蛋白的基因、FPKM<0.5、长度<200nt，去除具有编码能力转录本：CPC，CPAT，CNCI；剩余转录本用筛选含有已知蛋白结构域：Pfam HMM。  

  miRNA靶向的LncRNA预测：以miR399的靶基因IPS1为标准，miRNA和LncRNA之间互补配对错配少于4个碱基，预测的miRNA切割位点被3nt错配茎环中断。成熟木薯miRNA：http://www.mirbase.org/。  

  sRNA比对LncNAT：STAR，可视化：customized script。

  研究结果

  1、木薯幼苗冷胁迫/干旱胁迫lncRNA鉴定流程

  处理+对照共9个样品（15.5G/样），最终鉴定到682高质量lncRNA。

  2、木薯lncRNA特征

  A.木薯mRNA和lncRNA在基因组

  D/E. lncRNA和lncNAT的保守性分析。F.所有转录本的保守性比较分析。（mRNA保守性最高，lincRNA最低）

  3、木薯胁迫下lncRNA表达量的变化

  A.各种转录本表达丰度统计。B.处理和对照间lncRNA丰度统计。C/D.处理和对照间差异表达lncRNA分析。

  E.不同处理差异表达lncRNA层次聚类热图。F.两种胁迫下差异表达lncRNA韦恩图。

  4、lncRNA表达量的qRT-PCR验证

  冷胁迫或干旱胁迫下lncRNA定量验证，MeACTIN（内参基因）。

  5、作为miRNA前体的lncRNA

  鉴定到一些木薯已知miRNA的前体lncRNA。7个lncRNA在胁迫处理和对照间表现出显着的差异表达。

  6、作为miRNA模拟靶点的lncRNA的预测

  A.共预测到16个lncRNA作为miRNA的模拟靶点。B/C/D/E. lncRNA159/340/119/和miRNA164/169/2775的3个靶基因的相对丰度比较（U6为内参基因）。lncRNA能够提高mRNA的丰度。

  miRNA164/169/2775在对照和冷胁迫及干旱胁迫下的相对表达量。

  7、木薯响应胁迫的lncNAT-siRNAs鉴定

  用siRNA测序数据比对lncNAT（约有18.34%作为siRNA的前体）

  A/B. lncNAT和正义转录本中不同长度大小sRNA的（全部和单一）reads数。

  sRNA reads（对照NC和低温处理CCA）比对到lncNAT-gene链上的位置。

  8、响应胁迫的lincRNA与顺式调控靶点的基因共表达分析

  LincRNA和相邻基因的表达层次聚类分析（胁迫处理/对照），一致和非一致性表达的模式均存在。

  qRT-PCR验证5个lincRNA与相邻基因的不一致性表达。

  9、差异表达lncRNA与反式式调控靶点的基因共表达分析

  和lncRNA共表达的功能基因分为45种分子功能类型（p<0.05），只有6种类型是两种胁迫下都与lncRNA共表达。

  差异表达lncRNA靶基因的KEGG富集分析。颜色代表显着水平（红-蓝：由高到低），圆大小（比对到各通路差异基因个数）。

  研究亮点 

  1、  对木薯首次进行比较全面的lncRNA测序报道，同时对木薯生产影响很大的冷胁迫和干旱胁迫下响应的lncRNA做出来进一步分析，包括lncRNA的分布注释以及丰度分析，并且进行的了qRT-PCR验证。  

  2、  对作为miRNA和siRNA前体的lncRNA作出预测，并且对linRNA和miRNA的模拟靶点进行预测分析。  

  3、  对lncRNA顺式和反式作用的靶基因进行共表达网络分析，并针对胁迫处理和对照间差异表达lncRNA反式作用的差异靶基因进行功能注释。

  参考文献  

  Genome-wide identification and functional prediction of cold and/or drought-responsive lncRNAs in cassava[J].Sci Rep. 2017.IF=5.228