结合宏转录组和RNA-SIP分析深海热泉的活性化能自养群体
发布日期：2019-03-19 浏览次数：3391
研究背景：
海底岩石的化能自养微生物群落潜在地给深海海洋提供大量有机碳，而我们对海底有机体复杂的活动及代谢过程知之甚少。本文结合宏基因组、宏转录组、和RNA稳定同位素探测（RNA-SIP），分析一个活跃的海底火山（Axial Seamount）在低温热液下活跃的自养细菌及古细菌的代谢潜能、表达模式、通路。
宏基因组和宏转录组发现硫、氢基因和转录本，以及氨氧化、氧呼吸、脱氮作用、产甲烷作用，以及多个固碳途径。再通过RNA-SIP实验，模拟海底环境，随着温度降低，富集的13C在分类和功能多样性出现差异。
在30℃和55℃，主要是变形菌纲，氧化氢及减少硝酸盐的反应。产甲烷的古菌在55℃出现，并且在80℃时仅有产甲烷的古菌。相应的，随着温度的升高，主要的CO2固定途径从还原三羧酸（rTCA）变为还原乙酰辅酶A途径。
本研究结合RNA-SIP及宏转录组，阐明了不同的自养微生物群落在深海热泉喷口随温度梯度变化的存在形式和活性。
材料与方法：
1、流体收集
（深海热泉使用深海研究潜艇ROV ROPOS从Marker113喷口收集，深度1521米）。
2、RNA-SIP的基本技术路径：
利用稳定性重同位素底物（13C标记的碳酸氢钠）原位培养复杂环境样品；超高速离心获得目标微生物群落的重同位素RNA并进行下游分析。RNA-SIP实现了单一微生物向复杂微生物群落研究的转变，为在群落整体水平系统研究微生物在自然环境中重要生理过程的分子调控机制、定向发掘重要微生物资源和生物技术开发提供了关键技术支撑。
三个温度的RNA-SIP实验分馏。X轴-浮力密度，Y轴RNA浓度。
用符号表示的RNA用于文库制备和测序。12C对照组（自然群落），13C实验组（标记的化能自养群落）。
测序策略和分析流程：
测序：Illumina HiSeq 1000。PE，overlap 30bp，平均reads 160bp。
分析：组装、比对：CLC Genomics Workbench (v 7.0)
比对：Bowtie2
聚类：R统计程序、pvclust软件包
研究结果：
1、测序reads数和rRNA所占比例
（HFPS-海底热液小量采集器，LVWS-大体积水质采样器）
2、各温度下，四个SIP文库基于KO（KEGG Ontology）注释的相对丰度的层次聚类。
12C-light和13C-heavy的微生物群落的功能类似。
30℃时，ε-变形菌在四个文库中都存在，但在12C-light和13C-heavy中富集。
55℃时，12C-light和13C-heavy主要是ε-变形菌和产甲烷球菌，而13C-light和12C-heavy主要是放线菌、α-变形菌、β-变形菌。
80℃时，13C-light的组分与其它不同，主要是β-变形菌。其它三个文库中，主要是产甲烷球菌。
3、16S rRNA基因和注释转录本分类（13C-heavy）
A、宏基因组中，主要是δ-、ε-、γ-变形菌。古细菌所占比例（17%），产甲烷菌所占比例（9%）。
30℃，主要是Sulfurimonas（螺杆菌科）；55℃，主要是ε-变形菌、80℃，主要是甲烷暖球菌属。
B、宏转录组中，主要是α-、ε-变形菌、产甲烷菌。
30℃，主要是Sulfurimonas（螺杆菌科）；55℃，主要是Caminibacter、Nautilia、甲烷暖球菌；80℃，主要是甲烷暖球菌属、热球菌。
4、固碳途径中基因注释的百分比
5个固碳途径：还原TCA（rTCA）途径、还原乙酰辅酶A途径、3-羟基丙酸途径、3-羟基丙酸/4-羟基丁酸酯途径、Calvin Benson Bassham（CBB）途径。
rTCA途径最丰富。
5、固碳途径中基因的分类注释
6、氧、氮、硫、氢和甲烷代谢关键基因的注释百分比
在宏基因组中，关键基因都表达。
在宏转录组中，细胞色素C氧化酶基因复合体表达量最高。
7、氧、氮、硫、氢和甲烷代谢关键基因的分类注释
在宏转录组中，表达量最高的coxABCD被分类为α-、β-、ε-变形菌。
亮点分析：
通过宏基因组和宏转录组，首先确定分类多样性及微生物代谢潜力范围。然后用RNA-SIP模拟海底条件，氢富集培养，特定针对海底化能自养微生物，以确定不同温度下的关键类群和关键的代谢过程。
参考文献：
Coupled RNA-SIP and metatranscriptomics of active chemolithoautotrophic communities at a deep-sea hydrothermal vent.
The ISME Journa. 2016, IF= 9.328
