转录组学与蛋白组学联合分析

  分类地位：Solanum melongena L.  

  双子叶植物纲，茄目，茄科，茄属

  摘要    

  光是影响花青素生物合成的关键环境因素，“Lanshan Hexian”是一种光敏感型茄子。通过超高效液相色谱-串联质谱鉴定出两种主要花青素成分，并使用RNA-seq和iTRAQ技术研究了花青素积累的三个时间点。差异表达基因和差异表达蛋白质的相应相关系数分别为0.6936, 0.2332和0.6672。花青素生物合成是一个显着丰富的途径，CHI, F3H, 3GT, 5GT和HY5在转录和翻译水平上都受到调节。此外，一些转录因子和光感受器可能参与光诱导花青素的生物合成，如：MYB113和TT8。瞬时表达测定表明SmMYB35，SmMYB44和SmMYB86同等型可能涉及光诱导的花青素生物合成途径。

  引言

  花青素是水溶性色素中最大的亚类，其能够为花和果实提供色素沉着，并通过类黄酮生物合成途径的分支进行合成。花青素在保护植物免受诸如极端温度，紫外线辐射和病原体攻击中发挥重要作用。 此外，花青素有助于预防人类许多疾病，如癌症和心血管疾病。  

  此研究以光敏感茄子品种“Lanshan Hexian”为研究对象，通过RNA-seq和iTRAQ技术分析光诱导的花青素生物合成机制。根据光照时间与花色素含量的关系，研究了3个时间点的花青素积累，包括起点(0d)，最快点(5d)和最高点(12d)，为研究茄子中光诱导花青素生物合成的分子机制提供了新的认识，有助于提高植物花青素含量的遗传工程。

  材料与方法  

  检测平台：UPLC-Q / TOF MS；  

  数据采集：MassLynx 4.1；  

  样品的定性和定量：Agilent 2100；ABI StepOnePlus RT-PCR系统；  

  测序平台：Illumina HiSeqTM 2000  

  转录组学  

  3个生物重复  

  生物信息学分析：PCA、相关性分析、筛选差异基因、GO分析，通路富集分析，聚类分析和转录因子的测定 

  iTRAQ定量蛋白  

  SCX：LC-20AB HPLC Pump system (Shimadzu, Kyoto, Japan)；  

  LC-ESI-MS/MS分析：Triple TOF 560（AB SCIEX, Concord, ON）

  结果  

  1.茄子皮中光诱导的花青素积累

  转录组学与蛋白组学联合分析  

  图1 光对果实颜色的影响  

  (a) 在移除纸袋 0d，2d，4d，6d，8d 和 10d后“Lanshan Hexian”茄子果皮颜色的变化；(b)在移除纸袋0d到12d内花青素含量的变化.

  2.茄子皮中花青素的UPLC-MS / MS分析

  转录组学与蛋白组学联合分析  

  图2 茄子中花青素的质谱图及其结构 

  (a)一级质谱图(保留时间: 8.25min)；(b)一级质谱图(保留时间: 8.74min)；(c)二级质谱图(保留时间: 8.25min)；(d)二级质谱图(保留时间: 8.74min)；(e)结构: 花翠素-3- [4-(顺式-对-香豆酰基)-鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷]-5-吡喃葡萄糖苷(保留时间: 8.25min)；(f)结构:花翠素-3-[4-(反式-对-香豆酰基)-鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷]-5-吡喃葡萄糖苷(保留时间: 8.74min).

  3. 转录组分析概述  

  从9个样品中共获得32,028个基因或转录本。根据|log2 ratio|≥1，p<0.001和 FDR≤0.001， 共发现784例(5d vs 0d)，516例(12d vs 5d)，1,043例(12d vs 0d)差异基因，其中534， 308和715例上调基因，250例，208例和328例下调基因。

  4. 定量蛋白质组学分析概述  

  使用iTRAQ技术从茄子皮中鉴定出了42,021(重复1)，40,438(重复2)和36,155(重复3)光谱。 在数据滤波消除低分光谱后，35,638(重复1)，34,035 (重复2)和30,198(重复3)独特光谱匹配到10,199(重复1)，10,064(重复2)和9,347(重复3)独特肽，以及从茄子皮中鉴定3,237(重复1)，3,220(重复2)和3,148(重复3)蛋白质。差异表达蛋白(DEP)被定义为相对丰度大于1.5倍变化，p<0.05的蛋白质。 总共鉴定出293(5d vs 0d)，228(12d vs 5d)和451(12d vs 0d)DEPs。

  5. 转录组和蛋白质组数据的比较分析  

  转录组学与蛋白组学联合分析  

  图3 蛋白质与mRNA表达的相关性  

  (a)在转录组和蛋白质组数据集中定量的基因之间的关系的散点图。(b)DEPs和DEGs之间的散点图和相关系数。蛋白质之间的散点图和相关系数与mRNA表达比例相同（c）或相反（d）变化趋势。黑色表示没有DEPs和DEGs；蓝色表示有DEPs，但没有DEGs; 绿色表示有DEGs，而没有DEPs; 红色表示有DEPs和DEGs，所有数据进行log2转化。  

  转录组学分析鉴定出784(5d vs 0d)，516(12d vs 5d)和1,043(12d vs 0d)DEGs，其中209(5d vs 0d)，157(12d vs 5d)和270(12d vs 0d)有其对应的蛋白质定量信息。在转录(差异倍数> 2倍和FDR<0.001)和翻译(差异倍数>1.5倍和p<0.05)水平上，共有134个基因(命名为cor-DEGs-DEPs基因)，包括52(5d vs 0d)，39(12d vs 5d)和106(12d vs 0d)基因，。 在134个cor-DEGs-DEPs基因中，48(5d vs 0d)，24(12d vs 5d)和101(12d vs 0d)基因显示相同的趋势，而4(5d vs 0d)，15(12d vs 5d)和5(12d vs 0d)基因在两个水平上呈现相反的趋势。

  6. GO和通路富集分析cor-DEGs-DEPs基因  

  cor-DEGs-DEPs基因的KEGG富集通路以P＜0.05作为阈值，134个Cor-DEGs-DEPs基因被映射到99 KEGG通路。结果表明，3种KEGG通路在mRNA和蛋白水平均高度富集，包括“代谢途径”(ko01100)，“次生代谢物的生物合成”(ko01110)和“光合作用”(ko00195)。此外，次生代谢的KEGG通路在cor-DEGs-DEPs基因中显着富集，如“抗坏血酸和藻酸盐代谢”(ko00053)，“类黄酮生物合成”(ko00941)，“花青素生物合成”(ko00942)和“类胡萝卜素生物合成”(ko00906)，表明这些过程在光照后高度活跃。

  7.cor-DEGs-DEPs基因中表达模式的聚类分析  

  转录组学与蛋白组学联合分析  

  图4基于转录组学数据的cor-DEGs-DEPs基因的

  分层聚类分析  

  (a)所有cor-DEGs-DEP的热图；(b)所有上调基因和蛋白质的热图表达模式。 

  注：黄色表示上调的转录物或蛋白质；蓝色表示下调的转录物或蛋白质；黑色表示不变的转录物或蛋白质。每行代表基因或蛋白质的log2（Sample1 / Sample2）。热图的色标范围为自然对数刻度的饱和蓝（值-6.0）至饱和黄（值6.0）。

  8. 所有上调-下调基因转录本的分析  

  两个花青素生物合成基因CHI和F3H，以及两个修饰基因3GT和5GT在上调-下调基因表达模式H组中被发现(图4a)。进一步的分析表明在转录水平上90个转录本具有和花青素生物合成相同的表达模式。在这90个上调-下调转录本中鉴定出10个花青素生物合成相关基因，10个基因编码转移酶，和10个转录因子(TFs)，包括7个AP2-EREBP，2个WRKY和GRAS通过光诱导上调(表2)。总共有7种转录本能够定量到与之相对应的蛋白质(21.2%)。定量蛋白质组学分析显示除了CHI外，其他6种蛋白质在5d vs 0d和12d vs 5d比较组中均表现为上调。

  9.所有上调-0基因转录本的分析  

  HY5作为花青素生物合成的显着调节因子在上调-0基因表达模式的F组中被发现(图4a)。进一步的分析表明在转录水平上409个转录本具有和HY5相同的表达模式。一些比较有意思的基因被鉴定，包括：5个PAL，CHI，F3'H，2个光感受器，17个转录因子，泛素蛋白 和34个基因编码转移酶(表3)。转录组学分析鉴定了60个上调-0转录本，其中11个能够定量到与之相对应的蛋白质(18.3%)(图4c)。如图4c所示，根据表达模式将这11个蛋白质分成两组：在5d vs 0d中轻微变化，但是在12d vs 5d中上调表达；在5d vs 0d中上调表达，但是在12d vs 5d中轻微变化。

  10.所有下调基因转录本的分析  

  分析了下调-0，下调-下调和0-下调表达模式的转录本，以找到可能是与花青素生物合成相关但被光抑制的基因。 如表4所示，5个泛素基因在转录水平上表达为下调-0，包括HERC4，2个PIRH2和2个ATLs，另外3个泛素基因在转录水平上表达为0-下调，包括2个RMA1H1和RING1。 此外，在转录水平上，UVR8和24个转录因子表达为下调-0，包括MYB108，NAC，2 个WRKYs和3个HSFs，MADS-box为下调-下调表达，AP2-EREBP和HSF 为下调-上调表达，4 AP2-EREBPs， 2MYBs，4 WRKYs和TAG1为0-下调表达(表4)。然而，这些DEGs中没有一个具有相应的定量蛋白质信息。

  11.由光调节的MYBs和bHLHs的分析  

  转录组学与蛋白组学联合分析  

  图5 5种SmMYBs或SmTT8与参与黄酮生物合成控制的其他物种的MYBs或bHLH的系统发育关系  

  (a)MYB蛋白质序列；(b) bHLH蛋白质序列

  11.1 MYBs  

  使用5个SmMYBs(命名为SmMYB35，SmMYB44，SmMYB86，SmMYB108和SmMYB113)的全长蛋白质序列产生系统发育树，将所有的基因与已知花青素相关的MYBs聚集(图5a)。如图5a所示，SmMYB113分为正调节器类，其余四个SmMYBs分为负调节器类。此外，通过PLANTCARE分析了5个SmMYB的启动子，并鉴定了许多光响应元件。引人注目的是，在SmMYB35启动子中发现含有ACGT的元件(ACE，HY5结合位点)，并且在SmMYB44 / SmMYB86启动子中发现MYB结合位点(MBS)元件。

  11.2 bHLHs  

  使用引导序列分析(1000个重复)建立无分级的NJ新系统发育树来分析三种SmbHLHs和所有已知参与“MBW”复合物的拟南芥，Malus×domestica，Vitis vinifera，Fragaria×ananassa，Solanum lycopersicum，Prunus persica，Petunia×hybrid和Medicago truncatula bHLH蛋白的关系(图5b)(Li et al., 2016；Rahim et al., 2014)。如图5b所示，SmTT8聚集成bHLH3进化枝。然而，Sme2.5_04864.1_ g00002.1和Sme2.5_29845.1_g00001.1不适合进入邻接树，这可能是由于两个基因为不完整序列。  

  12.5个SmMYBs和SmTT8活性的瞬时色彩分析  

  转录组学与蛋白组学联合分析  

  图6 SmMYB35, -44, -86-1, -86-2, -108, -113和SmTT8的瞬时测定  

  (a)SmMYB86两个剪接转录本的示意图。 绿色框，红色框和线条分别显示为推定的ORF，选择性剪接片段和内含子。(b) 在烟叶中，通过SmMYB113单独渗透并与SmTT8共同渗透，而不是通过对pHB、SmMYB35、- 44、- 86- 1、- 86- 2、- 108和SmTT8的联合渗透而产生的花青素。EV表示空向量。(c)与对照组相比，SmMYB35增强花青素的积累，而SmMYB44和- 86- 2抑制。对照组为空载体pHB与SmMYB113和SmTT8共渗透。(d)共渗透点中花青素生物合成基因mRNA水平的QRT-PCR分析。测量值表示为对照水平的百分比。

  参考文献  

  Jing Li, Li Ren, Zhen Gao, et al. Combined transcriptomic and proteomic analysis constructs a new model for light-induced anthocyanin biosynthesis in eggplant (Solanum melongena L.), Plant Cell Environ.