利用转录组学和代谢组学分析番茄座果对细胞壁转化酶活性升高的响应

  在目前各种类型的组学中，如基因组学、转录组学、蛋白组学以及代谢组学，单组学研究都比较热门，其结果固然很有意义，但如果我们把不同组学结果进行深入整合分析，实现从原因和结果两个方面探究生命现象的分子本质，这将使得我们的研究更全面、更可靠。  

  下面以一篇文章为例，联合转录组学和代谢组学分析番茄座果对细胞壁转化酶活性升高的响应机制。

  

  研究背景  

  座果是确定许多作物产量潜力的关键过程。然而，大多数果实生物学研究都集中在中晚期的发展阶段，特别是与果实膨胀，糖积累和成熟有关。只有少数研究探索了果实的分子调控，其特征是从静止子房向快速生长的小果过渡，是果实发育的最早阶段。  

  细胞壁转化酶(CWIN)在质粒中将蔗糖(Suc)水解成葡萄糖(Glc)和果糖(Fru)，已被证明在包括果实和种子在内的库器官的发育中起重要作用。一个典型的例子来自玉米中的Mn1突变体，由于其编码CWIN和INCW2而表现出微型种子表型，进而导致CWIN活性降低和细胞分裂。在水稻中，编码CWIN的GIF1是谷物灌装的关键调节剂。GIF1 过度表达导致转基因品系的谷物越来越大且重。沉默番茄中CWIN基因Lin5 导致果实败育，然而提升CWIN活性则促进了果实和种子的发育。由CWIN介导的水解Suc产生的己糖不加载到子房/小果，但可以作为信号分子调节发育，并作为能量来源和代谢和生长的基础。阮等人提出了糖介导的种子和果实种子的模型，其中由CWIN产生的Glc信号被假设为促进细胞分裂并抑制成功座果的程序性细胞死亡途径。然而，基于CWIN介导座果的分子途径仍然是未知的。

  

  材料与方法  

  突变型番茄植株：Solanum lycopersicum XF-2，将抑制CWIN活性的基因SlINVINH1 沉默，保持转基因型和野生型植株生长条件(光照，温湿，水肥等)一致。分别采集2 dba和2 daa的子房和小果并在液氮中速冻，于-80℃保存供后续试验使用。  

  转录组测序  

  三个生物学重复；  

  检测平台: illumina Hiseq 2000；  

  总RNA质量测定: Agilent 2100；  

  评估生物分析仪和测序的原始读数的质量: FastQC；

  

  代谢组学分析  

  样品冷冻干燥，5g(干重)用于代谢物提取。  

  检测平台：GC-MS  

  CLC Genomics Workbench(9.0)用于转录组和代谢组学数据的主成分分析(PCA)； 

  实时荧光定量qRT-PCR  

  SlCAC 和SlTIP41 作为内参基因

  

  结果分析  

  1SlINVINH1-RNAi和WT植株中差异表达基因的鉴定  

  酶活性检测确认了SlINVINH1-RNAi植株的子房和座果中的CWIN活性升高。在2 dba子房和2 daa小果中，CWIN活性确实显着升高(与补充图S1相比)，其与我们最近的报道结果相一致。重要的是，液泡转化酶(VIN)和胞质转化酶(CIN)的活性在转基因植物中没有受到影响(补充图S1)，证明了SlINVINH1 对CWIN的特异性抑制作用。为了验证，我们进行了RNAseq分析，以发现哪些基因或基因互作对RNAi植株中CWIN活性升高有响应。

  

  Fig. 1. Differentially expressed genes during fruit set in wild type (WT)

  

  and SlINVINH1-RNAi tomato.  

  在番茄基因组中的34727个基因中，RNAseq分析表明，其中约58％在两个发育阶段或RNAi和WT植株之间表达差异很小。然后鉴定了WT和SlINVINH1-RNAi植株座果中差异表达的基因(DEGs)。在子房-小果转化期间，WT和SlINVINH1-RNAi植物分别检测到5183和3262个DEGs(图1A，补充表S2和S3)。这些基因在番茄基因组中分别占15.0％和9.4％。有趣的是，在座果中，SlINVINH1-RNAi植株中的DEGs数量远低于WT(图1A)。  

  Table 1. Functional classification of differentially expressed genes during fruit set in wild type (WT) and SlINVINH1-RNAi plants.

  

  使用MAPMAN对WT植株中5183个DEGs进行功能分类，结果显示，座果主要在蛋白质(BIN29)，RNA(BIN27)和运输(BIN34)类别中表现出变化。蛋白质类别(BIN29)占WT植株中DEGs的14.7％(表1)。蛋白质(BIN29)类别包括蛋白质合成(BIN29.2)，蛋白修饰(BIN29.4)和蛋白质降解(BIN29.5)。RNA(BIN27)类别是第二大组，占12.9％(表1)，可进一步划分为RNA加工(BIN27.1)，RNA翻译(BIN27.2)，转录调控(转录因子，BIN27.3)和RNA结合(BIN27.4)。在SlINVINH1-RNAi植株的座果组中发现了与WT座果组相似的功能类别，但在这些功能类别中DEGs数量更少。DEGs数量较多的前两个功能类别为蛋白质(BIN29)和RNA(BIN27)。与WT座果相比，SlINVINH1-RNAi中其他功能类别的排名略有改变(表1)。在两种基因型中涉及蛋白质(BIN29)和RNA(BIN27)的大量基因表明，座果是通过刺激蛋白质和RNA合成，调节和转换进行细胞快速发育的过程。  

  2CWIN活性升高独有的497个差异基因中与光合作用相关的基因大多数下调表达  

  Venn图显示了SlINVINH1-RNAi植物座果中独有的DEGs。该分析显示，在座果中大多数DEGs(2765)均属于两种基因型，只有497个DEGs对于提高的CWIN活性是独一无二的(图1B和补充表S4)。

  

  特别值得注意的是，在497个DEGs之间观察到光合作用相关基因的表达模式。与SlINVINH1-RNAi植株的2 dba子房相比，编码光合作用蛋白质的14个DEGs中，除了编码rubisco活化酶的基因外，其他13个都下调表达(表2)。这些光合作用相关基因编码在不同光合作用过程中起作用的蛋白质。其中，9个转录本编码光反应的蛋白质，1个作用于光呼吸，另外4个作用于Calvin-Benson循环。对于那些作用于光反应的DEGs，3个转录本编码叶绿素a/b结合蛋白(表2)。

  

  Table 2. Elevation of CWIN activity in the SlINVINH1-RNAi plants  

  suppressed the expression of photosynthesis-related genes  

  during fruit set compared with that in the wild type tomato plants.

  

  

  与大量光合作用基因的抑制一致，与WT座果相比，转基因植物的发育果实在10和15天绿色较淡(图2)，尽管这种表型在2 dba子房或2 daa小果中不明显。

  

  

  Fig. 2. Tomato fruits of SlINVINH1-RNAi (with up-regulated CWIN activity) were a lighter green colour compared with those of wild type (WT) fruits at 10 and 15 d after anthesis (daa).

  

  3相对于小果，子房对于CWIN活性升高的转录更为敏感

  

  通过转录组学比较了CWIN活性升高对WT和SlINVINH1-RNAi植株之间2 dba子房和2 daa小果的影响。子房和小果对升高CWIN活性的响应是不同的。在2 daa小果中，两种基因型之间的DEGs只有7个。然而，令人吃惊的是，在两个基因型之间的2 dba子房中发现了319个(图3)。这些数据显示，在基因转录水平上，2 dba子房对升高CWIN活性的响应要高于2 daa小果。

  

 

  Fig. 3. Differentially expressed genes in 2 daa ovaries and 2 daa fruitlets of SlINVINH1-RNAi (CWIN activity up-regulated) compared with those of wild type (WT) plants.

  

  在2 daa小果中的7个DEGs(图3)中，4个转录本在细胞壁，信号传导，生物胁迫和脂质代谢中编码蛋白质功能，还有3个转录本编码未知功能的蛋白质(表3)。已知功能的4个DEGs编码果胶酯酶，富含亮氨酸的重复(LRR)受体类似丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，含有核苷酸结合位点和亮氨酸富集重复(NBS- IRR)结构域和环丙烷-脂肪酰基磷脂合成酶。与WT小果相比，SlINVINH1-RNAi的2 daa小果中，除了编码R蛋白的基因表达上调外，其余6个DEGs都下调表达(表3)。

  

  Table 3. Differentially expressed genes in 2 daa fruitlets in response to elevated CWIN activity of SlINVINH1-RNAi compared with wild type fruitlets.

  

  对于在2 dba子房中两种基因型之间检测到的319个DEGs(参见补充表S5)，功能分类分析显示DEGs编码主要在蛋白质(BIN29)，代谢激素(BIN17)，RNA(BIN27)，应激(BIN 20)，信号传导(BIN30)和细胞壁(BIN10)(表4)。由于子房是在SlINVINH1-RNAi植株中对升高的CWIN活性有响应的主要器官，因此我们将随后的分析集中在2 dba子房，以进一步了解由提高CWIN活性调控的DEGs。

  

  Table 4. Functional classification of differentially expressed genes  

  in 2 dba ovaries of SlINVINH1-RNAi compared with those of wild type (WT) plants.  

  

  4在SlINVINH1-RNAi植株的子房中与蛋白质降解相关的基因被抑制以响应CWIN活性升高

  

  与WT植株相比，SlINVINH1-RNAi植株的子房中涉及蛋白质降解的DEGs有24个(表5)。这些DEGs编码各种蛋白酶，包括枯草杆菌蛋白酶，类丝氨酸蛋白酶家族的成员。与WT植株相比，SlINVINH1-RNAi植株子房中所有编码枯草杆菌蛋白酶的6个DEGs的转录水平降低。然而，编码半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶蛋白以及参与泛素-蛋白酶途径的那些DEGs表现出上调或下调(表5)。与WT植物相比，SlINVINH1-RNAi植株子房中超过70％(16/24)编码蛋白质降解功能的DEGs表达降低，说明与WT卵巢相比，蛋白质降解可能在SlINVINH1-RNAi植株的子房中被抑制(表5)。

  

  Table 5. Differentially expressed genes in ovaries of SlINVINH1-RNAi compared with those of wild type plants(部分).

  

  5在SlINVINH1-RNAi植株的子房中与激素相关基因的表达以响应CWIN活性升高

  

  在野生型植株的座果中，参与生长素，GA，乙烯代谢和信号传导的基因在“激素”基因类别中分别位于前三名，分别占总激素相关基因的27％，17％和17％(图4)。在SlINVINH1-RNAi植株中发现了类似的表达谱，在DEGs条目中涉及乙烯合成和信号的基因为第三重要的激素类别(图4)。这些发现表明，乙烯也可能是座果的重要参与者，与生长素和GA同等重要。

  

  Fig. 4. Percentages of expressed genes involved in hormone metabolism during fruit set.

  

  乙烯生物合成途径的最后一步是1-氨基-环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC氧化酶)催化氨基环丙烷-1-羧酸酯(ACC)转化为乙烯。在WT座果中，与2 dba子房相比，在2 daa小果中编码ACC氧化酶原的4个DEGs的表达水平降低，而其他15个DEGs的表达量增加(表6)。类似地，在SlINVINH1-RNAi植株中，与2dba子房相比，在2 daa小果中，4个ACC氧化酶转录水平降低，而其他9个转录水平增加(表6)。 结果表明，在WT和SlINVINH1-RNAi植株中，2 daa小果中的乙烯合成能力可能高于2 dba子房。与WT子房相比，在SlINVINH1-RNAi植株中的4种ACC氧化酶的转录表达上调，另外1个下调(表6)，表明在CWIN升高的子房中乙烯合成可能增强。

  

  除了乙烯合成基因外，与WT子房相比，在SlINVINH1-RNAi子房中编码乙烯应答因子(ERF)基因的表达上调了2.83倍(表5)。与WT植株相比，在SlINVINH1-RNAi子房中编码ERF3和ERF2a的基因表达水平也分别上调了2.26倍和0.78倍。这两个ERFs被注释到APETALA2 /乙烯应答元件结合蛋白家族的病原性发生相关(PR)转录因子(表5)，并已被证明能够结合几个PR基因的启动子。编码ACC氧化酶蛋白的大多数转录物的表达上调以及3种ERFs的上调意味着，与WT植物相比，SlINVINH1-RNAi的2 dba子房中乙烯生成和对乙烯的敏感性最高。

  

  Table 6. Numbers of differentially expressed genes encoding 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase proteins.

  

  6在SlINVINH1-RNAi植株的子房中与应激相关基因上调表达以响应CWIN活性升高  

  CWIN参与胁迫反应，包括生物胁迫和非生物胁迫。在生物胁迫期间，编码含有NBS-IRR结构域的蛋白质的R基因通常被表达为与病原体效应物蛋白相互作用。植物已经进化了数百种R基因，通过激活防御反应(包括PR基因表达)来防御病原体。在本节中，我们重点介绍了应激相关基因R和PR基因在座果中的表达及其对升高的CWIN活性的反应。  

  与WT植株相比，SlINVINH1-RNAi的2 dba子房中编码R蛋白的6个DEGs中5个上调表达(表5)。其中，3个R基因含有Toll /白细胞介素-1受体(TIR)基序，其中1个R基因在N-末端区域含有螺旋线圈(CC)基序；另外2个R基因可能缺少N端基序列(表5)。除了R基因，与WT植株相比，在SlINVINH1-RNAi植株的2 dba子房中编码内切壳几何蛋白酶的2个基因表达被改变(表5)。内毒素酶属于PR蛋白家族。因此，提高CWIN活性不仅增强了R基因的表达，而且与WT植株相比，SlINVINH1-RNAi植株的2dba子房中PR基因的表达也被改变。

  

  7在SlINVINH1-RNAi植株的子房中与细胞壁相关基因对CWIN活性升高的响应  

  与WT植株相比，SlINVINH1-RNAi 植株的2 dba子房中13个DEGs编码参与细胞壁代谢的蛋白质，包括纤维素合成酶，内切-1,4-β-葡聚糖酶，β-木糖苷酶，木葡聚糖内切葡聚糖酶/水解酶2，果胶酯酶，果胶乙酰胆固醇和膨胀素(表5)。这些细胞壁相关基因表达的变化表明，与WT植株相比，SlINVINH1-RNAi 植株的2 dba子房中的CWIN活性升高影响细胞壁代谢。

  

  8在SlINVINH1-RNAi植株的子房中与RLK相关基因大幅度下调表达以响应CWIN活性升高  

  与WT植株相比，SlINVINH1-RNAi植株的2 dba子房中有13个DEGs编码RLK蛋白，其中11个表达水平表现出降低 ，包括编码细胞质RLK的2个DEGs(表5)。不同于预期定位于质膜的其他RLK，这2种受体细胞质激酶缺乏细胞外结构域，导致其细胞质局部化。有趣的是，与WT相比，SlINVINH1-RNAi植株子房中的小GTP酶基因(植物的Rho，ROP)的表达也下调(表5)。

  

  9在SlINVINH1-RNAi植株的子房中与细胞周期相关基因上调表达以响应CWIN活性升高  

  座果的特征在于细胞分裂密集，这可能起源于CWIN活性的Glc信号激发的过程。因此，我们分析了细胞分裂相关基因的表达，以了解它们如何对升高的CWIN活性作出反应。我们发现，与WT植物相比，SlINVINH1-RNAi植株的2 dba子房中编码细胞周期蛋白B2的2个DEGs表达上调(表5)。

  

  10通过qRT-PCR 对RNA-Seq数据验证  

  为了验证RNA-seq数据，从表5中选择了6个DEGs，用于从RNAi和WT植物的2 dba子房中各自转录本的qRT-PCR测定。 分析显示，所有6种基因在两种基因型之间的RNA差异倍数表现出相同的趋势。通过qRT-PCR测定的倍数变化通常低于RNA-seq分析的倍数变化，这可能是由于两种方法之间的灵敏度和特异性的差异。重要的是，两个数据集之间的回归系数为0.7144（见补充图S2），这在报道的RNA-seq和qRT-PCR结果相关的范围内。因此，研究结果表明RNA-seq数据可靠。

  

  11座果初级代谢物分析  

  为了了解如上所述的CWIN介导的转录本分析的变化是否影响座果中的代谢，我们对用于RNAseq的同一组样品进行了代谢组学分析。总共测定了55种代谢物，并将它们分为四组：(i)氨基酸；(ii)糖和糖醇；(iii)有机酸和(iv)杂类(表7)。  

  在24个氨基酸中，与WT植株相比，22个氨基酸在RNAi植株的子房中的表达水平略低，尽管只有异亮氨酸和色氨酸显着性降低(表7)。在子房到小果过渡期间，WT植株中6个氨基酸显着增加，转基因植株观察到相似的趋势。值得注意的是，在两种基因型的子房-小果转化期间，甲硫氨酸(乙烯生物合成前体)翻了一倍(表7)。  

  对于糖和糖醇组，与WT植株相比，除了果糖，岩藻糖和异麦芽酮糖显着降低外，大多数在RNAi植株子房中没有显着变化(表7)。有趣的是，在WT和SlINVINH1-RNAi植株中，从子房到果实转化期间，G-6-P和F-6-P都显着性增加，但不受转基因植株子房中CWIN活性升高的影响(表7)。  

  在子房-果实转化期间，两种基因型中其它代谢物都显着增加，包括麦芽三糖，琥珀酸，烟酰胺，烟酸和葡萄糖醛酸。在这些代谢物中，有趣的是，与其对应的WT植株相比，在CWIN升高的转基因植株子房和小果中葡萄糖醛酸，琥珀酸和烟酰胺显着增加(表7)。

  

  12转录组和代谢组数据的主成分分析  

  转录组和代谢组学数据的主成分分析(PCA)显示研究的果实发育阶段和基因型之间的差异。二维图中每个点表示不同样品的转录组或代谢组。我们观察到子房在CWIN升高的响应(图3)中的显着变化，转录组和代谢组之间在CWIN升高和WT植株之间明显分离(表7)。然而，在小果阶段(2 daa)，在两种基因型之间是无法区分转录组差异。相比之下，使用代谢组学数据将它们分成两个不同的簇(图5)。我们将这一发现归因于代谢组学相对于转录组学更能够识别CWIN活性的差异。  

  Table 7. Primary metabolites levels in ovary (2 dba) and fruitlets (2 daa) of the wild type (WT) and SlINVINH1-RNAi line(部分).集思慧远客户发表文章《利用转录组学和代谢组学分析番茄座果对细胞壁转化酶活性升高的响应》

  

  

  

  Fig. 5. Principal component analyses (PCA) of transcripts and metabolites during fruit set.

  

  参考文献  

  [1]Transcriptomic and metabolomic responses to elevated cell wall invertase activity during tomato fruit set. Journal of Experimental Botany, 2017(68:15), 4263–4279. IF=5.830.