改变玉米PLA1的表达量会增加生物量和种子产量

  摘要：  

  玉米是世界上种植谷物或青贮饲料的最高产量的谷类作物。  

  一种被称为KLUH的细胞色素P450 CYP78A被证明可以产生生长促进信号，促进细胞增殖，调节植物的营养和生殖器官生长。在水稻中，证明KLUH同类型的CYP78A的PLASTOCHRON1（PLA1）影响叶片萌发和营养生长时间。  

  本研究表明，调节玉米中编码细胞色素P450（CYP78A1）的PLASTOCHRON1（ZmPLA1）基因的表达，可以增加器官生长、幼苗活力、秸秆生物量和种子产量。实验结果提高了近交系以及杂交系在多个地点和多个季节的产量，较为可靠。转录组研究、激素测量、生长素响应基因DR5rev：mRFPer的表达表明：PLA1可以通过增加生长素起作用。时空分析表明，PLA1通过将分裂细胞较长时间维持在增殖的未分化状态，刺激叶延长的持续时间。

  方法：

  1、系统发育分析。  

  用代表性陆生植物的基因组进行BLAST，鉴定了CYP78A样基因预测的氨基酸序列。

  2、RNA测序分析。  

  Illumina NextSeq500。PE 75bp。

  3、IAA代谢物分析。  

  采五个植物混样作为一个生物重复，设三个生物学重复。每个样品鲜重50mg。通过LC-MRM-MS分析所有样品。

  4、DR5rev：mRFPer的表达定量。  

  将共聚焦图像转换为8-bit深度图像。由于叶片中的DR5rev：mRFPer表达在木质部周围的细胞中是最大的，因此将木质部细胞作为参考点，选择单个切片进行分析。

  结果：

  1、 PLA1的过度表达刺激叶片生长。  

  （a）八个B104植物、UBIL：PLA1-P1、UBIL：PLA1-P2的完全生长的第九叶片的长度。（UBIL：启动子；UBIL：PLA1-P1、UBIL：PLA1-P2是过表达ZmPLA1的两个独立的转基因玉米；B104：野生型）  

  （b）与10个B104植物的平均值相比，两个UBIL：PLA1玉米的第九叶叶片面积统计。叶片面积显着增加。  

  （c）将芽转移到土壤后121天（UBIL：PLA1-P1）及135天（UBIL：PLA1-P2）的生长形态（正常生命周期70天）。叶片大小的差异影响了植物的形态和体积。  

  （d）与B104对照植物相比，UBIL：PLA1和UBIL：PLA1-P2植物的平均表皮成熟细胞长度降低。表明PLA1的表达刺激细胞分裂，产生更多、但较小的细胞。

  2、 PLA1的表达增加生物量和种子产量。  

  为了扩大PLA1的窄表达域，将PLA1基因克隆在GA2氧化酶（ZmGA2ox-在细胞分裂到细胞扩增中富集）基因的2,046-bp启动子序列后面。  

  （a）GA2ox：PLA1-P3分离株的幼苗（播种后12天；白色箭头表示新出现的叶）。  

  （b）GA2ox：PLA1-P3分离株的成熟植物（播种后96天）。  

  （c-e）三种独立的GA2ox：PLA1分离株中成熟叶的表型（叶面积、叶片长度、叶宽）。转基因植株都显着增加。  

  （f）GA2ox：PLA1-P2、非转基因、B104的叶片长度。随着叶片数增加，差异也加大。  

  （g）GA2ox：PLA1-P2、非转基因、B104的叶宽。随着叶片数增加，差异也加大。

  3、 GA2ox：PLA1-P2转基因株系在温室和田间的表型评价。  

  温室（a）和美国田间（b）试验中，GA2ox：PLA1-P2植株和非转基因植株的表型。转基因株系开花间期较短。  

  比利时（c，d）和美国（e，f）田间种植的GA2ox：PLA1-P2（T）X  CML91和非转基因GA2ox：PLA1-P2（NT）X CML91杂种的植物生长和繁殖表型。（CML91-近交系）。转基因植株叶表型增强。

  GA2ox：PLA1植株在多个生长季节的两个不同位置的田间条件下，叶片长度、宽度和叶片面积增加，植物高度增加，植物鲜重增加，茎宽度增加，每排籽粒数量、单粒数、穗长和穗粒数也增加。

  4、 PLA1通过延长细胞分裂持续时间来刺激生长。  

  （a）从第1天到第11天第四片叶的叶片延长率（LER）。转基因植株的LER显着并且可重复地增加。  

  （b）从第-1天到第8天第四片叶的分生区大小和LER值。为了检测PLA1是否通过延长分生区保持活性来促进细胞分裂，发现在转基因植株的稳态生长期间，分生区的大小与非转基因相比略微但并不总是显着更大。  

  （c）从第-1天到第8天第四片叶的叶片长度。在叶片生长的后期阶段，转基因和非转基因之间叶生长的差异越显着。  

  （d）在pla1突变体和野生型中分生区大小和LER值。pla1纯合突变体的叶长度缩短，分区的总体尺寸减小，最大生长速率过早下降。

  5、 寒冷夜晚或轻度干旱下GA2ox：PLA1与UBIL：GA20ox-1结合的表型。  

  （a-c）美国生长的UBIL：GA20ox-1 X GA2ox：PLA1杂种的叶延长率（a）、第四片叶的最终长度（b）、最终植株高度（c）等表型。与生长室和田间种植的植株相比，转基因生长期延长，最终叶大小和其他表型性状都增加。  

  GA2ox：PLA1在轻度干旱胁迫（d）和寒冷胁迫（e）下的叶片延长率。

  转基因和非转基因植物中都观察到LER的下降。  

  6、 PLA1的异常表达改变生长素代谢。  

  为了研究PLA1如何影响LER的机制，测了第四叶基底半厘米的转录组：稳态生长期（第四叶出现后2天）、叶长显着不同期（第四叶出现后6天）。  

  最显着上调的转录本是PLA1，分别比第2天和第6天的内源性PLA1转录本水平高51.8倍和47.5倍。  

  GO富集，红色和蓝色突出显示在两者都存在的上调和下调流程。下调的基因富集在“细胞周期停滞”、“生长素代谢过程”、“分生组织识别维持”。上调的基因富集在“光合作用”、“对光的反应”、“生长素介导的信号传导途径”。

  为了进一步分析异位PLA1表达对生长素代谢的影响，在稳态生长期间，沿着生长区3cm的采样间隔在0.5cm的采样间隔下测定生长素、前体的水平。  

  ANT，邻氨基苯甲酸酯；IAA-Asp，IAA-天冬氨酸；IAA-Glu，IAA-谷氨酸；IAA，吲哚-3-乙酸；IAM，吲哚-3-乙酰胺；IPyA，吲哚-3-丙酮酸；oxIAA，2-氧代吲哚-3-乙酸；TRA，色胺；TRP，色氨酸。  

  生长素以及生长素生物合成前体，如色氨酸（TRP）、吲哚-3-丙酮酸（IPyA）以及生长素失活产物（oxIAA）一致地高于非转基因株系。

  通过荧光定量和qRT-PCR在第四叶的基底半厘米中观察到的生长素应答报告基因DR5rev：mRFPer的水平升高证实了生长素的增加的积累。  

  mRFP（DR5rev：mRFPer）定位在周围韧皮细胞的木质部。共聚焦图像。

  亮点分析：

  1、PLA1的靶向过表达不仅对叶和植物大小和秸秆产量有正影响，而且影响种子产量。籽粒数量和籽粒重量的增加使最终谷物产量大幅增加。拟南芥中，升高的PLA1水平通过促进细胞增殖而产生更大的种子。番茄PLA1同源物的过表达通过在果皮和隔膜组织中产生更多的细胞来增加果实大小。本研究证明玉米PLA1基因的组织特异性和空间扩展的表达使秸秆和种子产量的同时增加。  

  2、GA2ox：PLA1在不同的遗传近交系和杂种背景下，在生长季节和地理位置不同的温室和两个独立田间试验中都有助于植物生长和产量。转基因效应加强了PLA1在其他谷物作物的生物量和种子产量的潜在效用。

  参考文献：  

  Altered expression of maize PLASTOCHRON1 enhances biomass and seed yield by extending cell division duration.  

  2017-nature communication-11.329