使用高效离子色谱结合Q轨道离子阱HF质谱仪研究头部和颈部癌细胞的靶向代谢组学分析

  摘要  

  在这项研究中，我们已经证明了基于高效离子色谱（IC）分离，轨道离子阱HFMS的靶向代谢组学方法用于高分辨率和精确质量（HR/AM）测量的癌细胞分析并使用稳定同位素标记的内标进行绝对定量。该方法为代谢物分析提供了巨大的技术优势，包括精确的灵敏度，高速和再现性，以及广泛的动态范围。高性能IC提供了在20分钟内对细胞代谢物快速分离，并为极性分子（包括许多同位素代谢物）提供了极好的分离能力。IC/QExactive HFMS实现了6个目标代谢物，丙酮酸盐，琥珀酸，苹果酸，柠檬酸，延胡索酸和α淀粉酸的5个数量级广泛的动态范围，R2≈0.99。基于该平台，可以在细胞样品中从低fmol/μL至nmol/μL水平同时定量代谢物。380μL/min的高流速IC对于大量样品（150次进样）显示出极好的重复性，保留时间的变化最小（SD<±0.03min）。此外，基于IC-MS的方法在同一时间分析运行中获得目标和全代谢组学数据，并使用稳定同位素标记的标准品帮助大规模代谢组学分析中靶向代谢物的精确定量。这种代谢组学方法已成功应用于头颈癌细胞以及癌症干细胞类细胞（CSCs）中目标代谢物的分析，并且结果表明代谢表型在高和低侵入性头颈癌之间以及CSCs和非SCCs（非干细胞癌细胞）之间可以明显区分。

  材料方法

  样品制备  

  使用球形化测定法来富集和分离来自培养的UM1癌细胞的干细胞类口腔癌细胞（CSC）和非干细胞癌细胞（NSCC）。UM1，UM2，UM5和UM6 头颈癌细胞培养在含有10％胎牛血清，青霉素（100U / mL）和链霉素（100μg/ mL）的改良Eagle培养基（DMEM）中。细胞维持在37℃下，湿润为5％CO2培养箱中，并且当它们达到90-95％融合时进行传代。 用细胞活力分析仪计数细胞数。  

  使用液氮快速冷冻甲醇/水提取的细胞代谢物。在冷室中用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）快速洗涤两次以除去培养基组分，然后用水快速漂洗。除去水后，将细胞用液氮和1.0mL 90％冷MeOH快速冷冻;然后立即向每个板中加入CHCl3，并用细胞刮擦/悬浮细胞。将提取物转移至微量离心管中并在4℃下以16100g沉淀3分钟。然后将上清液转移到新离心管中进行IC-MS分析。所有实验重复3至12次。  

  稳定同位素标记的内标由Cambridge Isotope 实验室提供。 六种稳定同位素标记的标准品包括丙酮酸，苹果酸，延胡索酸，琥珀酸，α-酮戊二酸和柠檬酸以相同浓度合并，然后连续稀释，范围为10000,5000,1000,500,100,50,10,5,1，0.5和0.1pg /μL（总共11次稀释）。将11个连续稀释的标准品混合物随机掺入细胞代谢物样品中（至少3个重复），用于癌细胞中靶向代谢物的绝对定量。

  离子色谱法  

  Dionex ICS-5000 + HPIC离子色谱与Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪偶联，用于靶向代谢组学分析。

  质谱分析法  

  Q Exactive HF质谱仪在ESI负离子模式下操作用于所有检测

  数据处理  

  在全扫描模式下采集数据。使用Thermo Scientific SIEVE 2.2软件进行总体数据的差异分析。使用Thermo Scientific Tracefinder 3.2软件进行目标化合物的定性和定量分析。简而言之，将六种同位素标记的化合物输入Tracefinder局部化合物数据库并与目标化合物匹配。 然后基于同位素标记的标准品建立标准曲线，以对目标化合物绝对定量。

  结果与讨论  

  Figure 1.（A）用Q Exactive HF MS通过IC分析六种稳定同位素标记的标准品。  

  （B）这些标准品化合物包括丙酮酸和三羧酸循环的中间体（琥珀酸，苹果酸，柠檬酸，延胡索酸和α-酮戊二酸）。

  表1 用于本研究的六种稳定同位素标记的标品

  代谢组学分析的高性能IC  

  糖单磷酸盐和二磷酸盐的成功分离是IC方法对代谢物分离质量很好的检测

  Figure2.（A）高分辨率IC结合Q Exactive HF MS对UM1癌细胞中11种糖单磷酸盐和（B）9种糖二磷酸盐进行分析。基于与标准品化合物匹配的MS/MS（插图）和保留时间，在7.94min洗脱的峰9被鉴定为果糖-6-磷酸。Q Exactive HF MS在负离子模式（<1ppm）下提供了母离子和产物离子的精确质量测定。基于与METLIN数据库匹配的MS/MS谱图或与标准化合物匹配的MS/MS谱图和保留时间鉴定的糖单磷酸盐或二磷酸盐。（C）具有大量进样次数（n=150）的果糖-6-磷酸（图2A中的峰9）IC分析的再现性。果糖-6-磷酸的保留时间平均值为7.93±0.03min（n=150）。

  定量目标代谢组学流程

  Figure3.基于高性能IC结合Q Exactive HF MS的靶向代谢组学方法用于HR/AM测量，以及使用稳定同位素标记的内标进行代谢物的定量。

  使用具有稳定同位素标记的内标物的IC-HR/AM（高分辨率/精确质量）-MS进行代谢物定量。将六种稳定的同位素标记的标准品以相同浓度混合，然后连续稀释，范围为10000,5000,1000,500,100,50,10,5,1,0.5和0.1pg/μL。然后将11个连续稀释的标准混合物随机加入细胞代谢组样品中，至少3个重复，对癌细胞中的6种目标代谢物进行绝对定量。在一系列稀释的标准品基础上，我们建立了每个内标的标准曲线，然后使用Tracefinder3.2程序，可以很容易地将内源代谢物与相应的同位素标记内标匹配，并准确定量其在细胞中的水平。

  尽管本研究的重点是靶向代谢组学分析，但IC-HR/AM-MS方法允许在癌细胞中进行全代谢物分析。因此，每种细胞类型的全代谢分析数据也可用于非靶向代谢组学分析。虽然HR/AM全扫描MS数据可以用于靶向定量分析，但是相同的数据也可以重新用于非靶向分析和/或再处理用于额外的目标化合物靶向定量分析。

  Figure 4. 6种稳定同位素标记标准品的5个数量级的广泛动态范围。从一系列11个稀释的标准品混合物0.1,0.5,1,5,10,50,100,500,1000,5000和10000pg /μL浓度范围建立校准曲线。

  为了从UM1，UM2，UM5，UM6，UM1-CSC和UM1-NSCC细胞制备的代谢组样品中定量目标代谢物，将连续稀释的同位素标记混合物掺入细胞代谢物组样品中，然后进样IC/Q Exactive HF MS用于定量分析。对于每个浓度水平的内标混合物进行加标实验，至少需要3个生物学重复，并且使用Tracefinder分析IC-MS数据。图4显示了六种稳定同位素标记标准品的标准曲线。Q Exactive HF MS允许定量这些目标分子至低fmol水平，具有5个数量级的广泛动态范围。定量范围在0.1-10000pg/uL内，其非常适合于癌细胞中的内源性代谢物的综合分析。

  Figure 5. 通过IC-Q Exactive HF MS对头颈癌细胞中6种靶向代谢物的定量分析。 这些代谢物在UM5癌细胞中的生成显着高于其他细胞系。 插图为所有4个细胞系的培养物。 最初平铺的细胞数目相等并且培养时间相同。

  在靶向分析的基础上，与UM2细胞相比，UM1细胞显示出更高的TCA代谢物水平，包括苹果酸，延胡索酸，柠檬酸和琥珀酸。然而，UM5细胞比其他细胞系（包括UM6）显示出所有六种代谢物更高的显着水平。我们发现与其他三种细胞系相比，UM5细胞中苹果酸，柠檬酸，延胡索酸和α-淀粉酸的水平至少高2倍（图5），而丙酮酸水平几乎增加了20倍。这似乎表明UM5细胞具有更积极的代谢表型，特别是丙酮酸的生成。如图5中所示UM5细胞培养物颜色显着改变，其细胞培养物pH显着低于UM1，UM2和UM6细胞培养物，这是由于UM5细胞中丙酮酸盐/乳酸盐的生成增加导致的。因此，UM5细胞中丙酮酸和其他TCA中间体的水平显着更高就可以理解了。我们的研究结果表明高侵入性头颈部癌细胞（UM5和UM1）表现出比低侵入性头颈癌细胞（UM2和UM6）更积极的代谢表型。

  Figure 6. CSC和NSCC中6种靶向代谢物的定量分析。 结果表明与NSCC相比，三种代谢物丙酮酸/柠檬酸/α-酮戊二酸在CSCs中增加，而延胡索酸，苹果酸和琥珀酸在CSC中降低。

  CSC和NSCC之间的六种代谢物的靶向分析结果（图6）证实了我们的结论。基于Cap IC-MS的非靶向代谢组学分析，在CSC中存在较高水平的丙酮酸盐，柠檬酸盐，顺式乌头酸盐，异柠檬酸盐和2-酮戊二酸盐，而当与非癌症干细胞（NCSCs）比较时，琥珀酸盐，延胡索酸盐和苹果酸盐显示逐渐降低的水平。在本研究中，使用靶向代谢组学分析观察到相似的结果，这表明非靶向和靶向IC-MS方法都可以定量癌细胞代谢组学分析。然而，这些代谢物在CSCs和NSCC之间表达差异的原因仍有待进一步研究。

  亮点  

  1.证明了基于高分辨率分离的IC，用于HR/AM测定的Q Exactive HF MS，以及使用稳定同位素标记的内标进行绝对定量的靶向代谢组学方法。该方法允许在分析运行中同时进行靶向和全代谢组学分析，并且提供了极大的优势，例如目标分子的高灵敏度，准确性和可重复性，以及细胞代谢物组的综合分析。  

  2. 该方法实现了6个目标代谢物的5个数量级的广泛动态范围。表明代谢表型在高和低侵入性头颈癌之间以及CSCs和非SCCs（非干细胞癌细胞）之间可以明显区分。

  参考文献  

  Targeted Metabolomic Analysis of Head and Neck Cancer Cells Using High Performance Ion Chromatography Coupled with a Q Exactive HF Mass Spectrometer