通过RNA-seq鉴定和分析野生大豆（Glycine soja）根中的NaHCO3胁迫应答基因

  文章标题：Identification and Analysis of NaHCO3 Stress Responsive Genes in Wild Soybean (Glycine soja) Roots by RNA-seq.  

  期刊：Frontiers in Plant Science.  

  影响因子：IF=4.495. 

  发表时间：2016年11月.  

  作者单位：National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, National Center for Soybean Improvement, Key Laboratory for Biology and Genetic Improvement of Soybean (General, Ministry of Agriculture), Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production, Nanjing Agricultural University, China.

  摘要： 

  土壤碱度是作物生产力和质量的主要非生物限制因素。野生大豆（Glycine soja）被认为比栽培大豆（G.max）更具胁迫耐受性，并且对于增加大豆的碱性耐受性有相当大的遗传变异。在这项研究中，通过RNA测序，分析了碱性耐受的野生大豆品种N24852在90mM NaHCO3胁迫12小时和24小时的根的转录组。与对照相比，在NaHCO3处理12小时和24小时后，共鉴定了449个差异表达基因（DEGs），包括95个和140个上调基因，108个和135个下调基因。14个DEGs的定量RT-PCR分析显示与RNA测序结果的高一致性。与转录因子和转运蛋白相关的GO富集分析显示，在NaHCO3胁迫后12小时和24小时显着富集上调基因。核因子Y亚基A（NF-YA）转录因子在NaHCO3应激后12小时富集，碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）、乙烯反应因子（ERF）、三螺旋和锌指（C2H2、C3H）转录因子在NaHCO3应激后12和24小时发现。与ABC转运蛋白、铝激活的苹果酸转运蛋白（ALMT）、谷氨酸受体（GLR）、硝酸盐转运蛋白（NRT）/质子依赖性寡肽（POT）家族、S型阴离子通道（SLAH）等离子转运蛋白相关的基因在NaHCO3处理后24小时富集上调基因，这意味着它们在碱性条件下维持大豆根中的离子稳态。KEGG通路富集分析显示“苯丙素类生物合成”和“苯丙氨酸代谢”途径可能参与大豆对碱胁迫的应答。这项研究为进一步调查碳酸氢盐胁迫应答基因的功能和大豆耐碱性的分子基础提供了根据。

  材料与方法：  

  材料：野生大豆（Glycine soja）。

  取材方法：对129个大豆品种初步筛选，鉴定出耐碱性野生大豆品种N24852。大豆种子用1％次氯酸钠表面灭菌30秒，并用去离子水冲洗三次。将二十粒种子播种在装有干净石英砂的塑料盆中。发芽后7天，将幼苗稀释至每盆四株植物。将四个罐放置在含有1.5L新鲜1/2浓度的Hoagland营养液（pH≈6.5）的塑料容器中，其可通过底部的小孔吸收营养液。当出现第二个三小叶（种植后约14天）时，施加包含90mM NaHCO3（最终pH为8.5，通过加入KOH调节）的处理溶液以诱导碱性胁迫。对照不含NaHCO3。实验设置三个生物学重复。处理12和24小时后，收集根尖（3cm），液氮中冷冻并储存在-80℃用于提取RNA。剩余的根组织和叶，用于测量离子浓度。

  测序策略和分析流程：  

  测序：Illumina HiSeq2500。共12个样本。原始reads共283.6M。clean reads共270.5M。 

  分析：比对到大豆参考基因组：Tophat2 (v2.0.13)； 

  基因表达水平标准化为FPKM：Cufflinks v2.2.2； 

  DEGs鉴定：R package DESeq；

  基因功能注释数据库：Nr (NCBI non-redundant protein sequences)；Pfam (Protein family)；KOG/COG (Clusters of Orthologous Groups of proteins)；Swiss-Prot (A manually annotated and reviewed protein sequence database)；KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)；GO (Gene Ontology)。

  功能注释软件：BLASTn (v 2.2.26) software；hmmscan (v 3.0) software；

  结果： 

  1、 野生大豆N24852对NaHCO3胁迫的表型和生理反应  

  N24852和Lee68在对照（CK）和碱性胁迫下的离子浓度和比率。  

  根中（A）Na+浓度，（B）Na+/ K+比率，（C）Na+/ Ca2+比率。 

  叶中（D）Na+浓度，（E）Na+/ K+比率，（F）Na+/ Ca2+比率。

  低Na+浓度的维持和Na+/ K+和Na+/ Ca2+的低比率被广泛用作植物耐盐性的指数。为了评价野生大豆N24852的碱度耐受性，使用耐盐大豆品种Lee 68用于比较。野生大豆N24852对NaHCO3胁迫表现出比Lee 68更大的耐受性。在NaHCO3处理后，两种大豆品种根中Na+的浓度，Na+/ K+和Na+/ Ca2+的比例增加，但野生大豆N24852根中Na+浓度、Na+/ K+和Na+/ Ca2+的比例显着低于Lee 68。N24852叶片中Na+浓度，Na+/ K+和Na+/ Ca2+的比例也低于Lee68。

  2、 NaHCO3胁迫下大豆根中差异表达基因（DEGs）的鉴定 

  碱性胁迫和对照之间差异表达的基因（DEG）的维恩图。 

  A12h：12h的碱性胁迫；A24h：24h的碱性胁迫。 

  与对照相比，NaHCO3胁迫下野生大豆根中总共有449个基因差异表达。在碱性胁迫12小时和24小时后，分别有95个和140个上调的基因、108个和135个下调的基因，在24小时碱性胁迫后检测到更多的DEGs，意味着24h后发生更多的转录变化。 

  3、 在两个时间点（12h和24h）均存在的差异表达基因（DEGs）的热图  

  在两个时间点，9个基因上调，20个基因下调，表明它们在大豆对NaHCO3应激反应中的重要性。重叠的上调基因包括两个铝激活苹果酸转运蛋白（ALMT）基因和一个编码胚胎后期富集蛋白（LEA）的基因。已报道ALMT转运蛋白在植物对非生物胁迫的适应中起作用，而LEA蛋白的积累是响应由干旱、高温、盐度引起的水分亏缺。

  4、 DEGs的功能分类和GO富集分析 

  NaHCO3胁迫12小时（A）和24小时（B）的上调基因的GO富集分析。带有ID的GO号写在框中。彩框差异显着，白框不显着。  

  在12小时的碱性胁迫下，具有转录因子活性的基因显着富集。 

  在24小时的碱性胁迫下，具有转运蛋白活性、碳水化合物结合的分子功能、参与生物过程转运的基因显着富集。 

  5、 基因表达水平的RNA-seq和qRT-PCR结果比较分析  

  （A）90mM NaHCO3胁迫后12h的14个基因（四个POD-过氧化物酶编码基因，三个在两时间点均上调的基因，两个在两时间段均下调的基因，五个仅在一个时间点上调或下调的基因）的log2倍数变化；  

  （B）90mM NaHCO3胁迫后24h的14个基因的log2倍数变化；  

  （C）RNA-seq（x轴）和qRT-PCR（y轴）获得的log2倍数变化的比较，显示高度一致性。  

  6、 转录因子相关的DEGs  

  12h（A）和24h（B）的NaHCO3处理的差异表达基因（DEG）的转录因子家族。共130和173个转录因子（TF）分别在NaHCO3胁迫后12h和24h差异表达。在差异表达的转录因子中，在两个时间点都发现碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）、乙烯反应因子（ERF）、三螺旋和锌指（C2H2、C3H）家族。核因子Y亚基A（NF-YA）家族在NaHCO3应激后12小时富集。这些转录因子已经被报道在植物对非生物胁迫的应答中起作用。

  7、 离子转运相关的DEGs 

  已报道ABC转运蛋白、ALMT家族、谷氨酸受体（GLR）、硝酸盐转运蛋白（NRT）/质子依赖性寡肽（POT）家族和S-型阴离子通道（SLAH）在离子转运中起作用，保持植物对NaHCO3胁迫的响应中的离子稳态。9个转运蛋白基因在NaHCO3胁迫后12小时差异表达（表1）。在NaHCO3胁迫后24小时，富集转运相关基因。24个转运基因上调，3个转运基因下调，包括编码ABC转运蛋白、ALMT、铵转运蛋白、水通道蛋白转运蛋白、阳离子外排子家族、GLR、NRT/ POT家族、SLAH、硫酸转运蛋白和锌/铁转运蛋白。研究结果表明这些转运基因在维持大豆对NaHCO3应激反应的稳态离子的重要性。

  亮点分析：  

  1、在本研究中，鉴定了耐碱性野生大豆品种N24852，其在NaHCO3胁迫下在叶和根中显示低的Na+浓度。 

  2、这项研究提供了一系列的NaHCO3应激反应基因，以帮助进一步了解植物对碱性胁迫的反应。