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文献解读

集思慧远客户发表文章《比较转录组分析揭示沙梨和互生交链孢霉的互作关系》

发布日期:2019-03-20 浏览次数:128

  摘要:  

  沙梨(Pyrus pyrifolia)生产的主要限制因素是由死体营养型真菌-互生交链孢霉引起的黑斑病。然而,梨对互生交链孢霉的分子水平反应机制未知。本文研究了抗性品种Cuiguan(CG)和易感品种Sucui1(SC1)对互生交链孢霉感染的宿主响应。使用RNA-Seq技术在互生交链孢霉感染的早期鉴定了CG和SC1之间的大量差异表达基因(DEGs)。K-mean聚类和Mapman分析显示,易感品种SC1中,参与乙烯(ET)生物合成和ET信号通路的基因(如ACS、ACOs、ERFs),以及过敏反应(HR)和程序性细胞死亡(PCD)的基因显着富集。抗性品种CG中,接种真菌后,响应过氧化氢和超氧化物的基因上调。SC1中,ET水平极高。CG中,解毒酶(例如过氧化氢酶)活性更高。研究结果表明,ET- / H2O2介导的PCD和解毒过程在梨和互生交链孢霉的互作中发挥重要作用。

  

  材料与方法:  

  材料:七年生的沙梨树(Pyrus pyrifolia)“Cuiguan”(CG)和“Sucui 1”(SC1),从果园收集叶子用于接种测定。  

  取材方法:25℃下,互生交链孢霉在马铃薯葡萄糖琼脂平板上的生长7天。用蒸馏水漂洗菌丝体获得分生孢子悬浮液。用针刺穿叶的近轴表皮,沿中心静脉的两侧形成四个感染部位,并接种。用灭菌蒸馏水作为模拟对照。将接种和模拟处理的叶在25℃的黑暗条件下孵育。接种后每天评估真菌生长过程的疾病严重性和疾病发生率。每次处理使用至少20片叶。实验重复5次。在接种后0,1,2,3和5天收集叶子用于RNA-seq。

  

  测序策略和分析流程:  

  测序:Illumina HiSeq2500。PE 100bp。每个时间点混合10片叶子,设置3个生物学重复。共30个样本。  

  分析:序列处理和差异表达基因分析;

  

  激素测量:气相色谱仪监测ET(乙烯)释放;  

  H2O2、O2-和抗氧化酶活性测量;

  qRT-PCR分析;

  

  结果:

  

  1、 在CG和SC1上接种A. alternata  

  (A)接种A. alternata的CG和SC1的代表性表型。  

  (B)CG和SC1分枝顶部的第四叶的病害发生率(具有扩大病变的接种部位的百分比)。

  (C)CG和SC1分枝顶部的第四叶的疾病严重性(扩张损伤的直径)。

  

  

  2、 RNA-Seq转录组数据的序列比对和表达分析

  

  在接种后不同时间点,30个样品中比对到沙梨和A.acalata参考基因组的比率。

  

  集思慧远客户发表文章《比较转录组分析揭示沙梨和互生交链孢霉的互作关系》-Frontiers in Plant Science-2017,IF=4.495

  

  在给定时间点CG和SC1中的独有和共有的差异上调(A)和下调(B)的unigenes个数。

  

  

  3、 时间表达谱分析

  

  通过k-mean分析,5个阶段前10个GO term的基因的表达谱。

  (A)CG中上调;(B)CG中下调;(C)SC1中上调;(D)SC1中下调。

  与过氧化氢、超氧化物、碳水化合物的响应相关的基因在抗性基因型CG中显著上调,但在易感基因型SC1中不显着上调。JA、ABA介导的信号传导途径和反应创伤和ET在SC1中的显着上调,在CG中下调。包括“光合作用”、“多糖生物发生”、“细胞壁组织”的生物过程在SC1中显著下调。

  

  

  4、 转录因子分析

  

  显示CG和SC1对生物胁迫的转录反应。使用Mapman软件显示具有显着差异表达的基因,并分成不同功能类别(BIN)。蓝色表示减少,红色表示增加。

  

  

  5、 乙烯含量鉴定

  

  在给定时间点,测量CG和SC1的接种叶中ET水平。在SC1中,ET水平比CG高得多。1dpi后持续增加,在5dpi达到峰值。

  

  6、 激素生物合成途径的基因表达

  

  CG和SC1中响应A. alternata感染的乙烯合成基因ACO1(A)和茉莉酸合成基因AOC(B)的表达。

  

  7、 H2O2和抗氧化酶的活性分析

  

  CG和SC1中响应A. alternata感染的H2O2和抗氧化酶的活性。在给定时间点测量CG和SC1的接种叶中O2-(A)、SOD(B)、H2O2(C)和CAT(D)的水平。

  

  8、 qPCR验证

  

  通过qPCR验证CG(A)和SC1(B)的RNA-seq数据。

  

  9、 模拟ET和H2O2介导的通路,确定沙梨和A. Alternata的相互作用

  

  当沙梨遇到病原体时,ET生物合成(ACS,ACO)和ET信号通路(ERF)被触发,并且诱导H2O2和O2-产生。因此,发生过敏反应(HR)和程序性细胞死亡(PCD),并成功感染SC1。ET生物合成和ET信号通路被抑制时,诱导CAT将H2O2分解成水和氧。随后,CG对病原体进行抗性应答。R,抗性基因型CG;S,易感基因型SC1;红色,上调表达或酶水平升高;绿色,下调表达或酶水平降低。

  

  

  亮点分析:  

  本文分析了互生交链孢霉感染沙梨期间的过敏反应和程序性细胞死亡、乙烯生物合成的作用、抗氧化酶的作用,最终揭示了沙梨对互生交链孢霉感染的抗性反应。