集思慧远客户发表《醋灸处理甘遂对大鼠肠道微生物群的调节及解毒作用》

Euphorbia kansui fry-baked with vinegar modulates gut microbiota and reduces intestinal toxicity in rats

IF=3.49

合作单位：江苏省中药方剂高技术研究重点实验室，

南京中医药大学

摘要

      民族药理学相关：甘遂(EK)，是一种有毒的中药，经常被用来治疗水肿、腹水和哮喘。用醋灸处理(VEK)可用于降低中药的毒性。以往的研究证实，醋灸可显著降低甘遂的胃肠道毒性。EK的毒副作用与肠道密切相关，但是现有的研究结果无法提供解毒的实用措施以及醋灸后EK的生物效应。研究目的：本研究通过对肠道微生物群的调节，研究EK的胃肠道毒性和Vek的解毒作用。雄性SD大鼠30只，随机分为3组。连续7天口服0.5%CMC-Na(C组)、EK(甘遂组)或VEK(醋灸甘遂组)粉。结果：与EK相比，VEK中的10种有毒成分显着降低。用醋炙后，VEK引起的副作用在组织病理学上、肠组织炎症损伤指数、肝功能和氧化损伤指数减轻。EK的毒性可能与乳酸菌和Blautia属密切相关。除此之外，醋灸后的EK增加了短链脂肪酸的产生，受到肠道微生物的调节。结论：醋炙后，主要益生菌比例增加，潜在致病菌减少。事实证明，用醋炙可以达到有效的解毒效果。

材料与方法

样本：甘遂根部；将100克干净的甘遂浸泡在30克醋中，在260℃下炒至出现轻微的焦斑。将干燥的EK和VEK磨成粉末，100目过筛。

检测平台：UPLC-QTOF/MS

十种参比物质：从EK根中分离出来，并通过光谱分析进行了鉴定。

动物和群体：SD大鼠体重(230 ± 20) g，充足的水和食物饲养一周后，被随机分为了3组，每组十只，分别给予口服0.5%CMC-Na、EK或VEK粉末。

生化分析和组织病理学检查：

采集颈动脉血样，用于测定血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和乳酸脱氢酶(LDH)。

采集大鼠小肠组织，检测小肠粘膜损伤程度（分为6个等级）和免疫组织化学研究。

粪样采集及16S rDNA微生物群落分析：

扩增16 SrDNA基因V4-V5区

515F：5‘-GTCCAGCCGCGG-3’；

907R：5‘-CCTCAATTCMTTGTTT-3’)。

短链脂肪酸测定：GC-MS

结果展示

1.UPLC-QTOF/MS分析鉴定EK和VEK之间区别最大的成分

为了彻底评价EK和VEK之间的化学变化，对两个样品进行UPLC-QTOF/MS分析，并利用MassLynx软件对保留时间(RT)、m/z离子对和离子强度的数据集进行了进一步的处理。鉴定了10个组分。其中，KansuinB，KansuinC，KansuinE，KansuinA，3-O-苯甲酰-20-脱氧炔诺醇，Kansuiphorin C，eupha-8,24-二烯-3β,11β-二醇-7-酮，3-O-(2’E，4’Z-癸二烯酰基)-20-O-乙酰炔诺醇，甘参酮，和3-O-二烯-1-(2’E，4’E-癸二烯酰基)-20-O-乙酰炔诺醇被视为毒性组分，相较于EK，VEK中的含量显著降低。

图1 EK和VEK的UPLC-ESI+-MS总离子(TIC)色谱图

2.对大鼠肠道组织病理学及炎症损伤指标的影响

基于H＆E染色，C组具有完整上皮细胞结构的小肠组织的正常组织学形态（图2A），而在EKC组大鼠中，观察到肠粘膜中的显着损伤。EKC组中发生的典型组织学特征的特征在于肠粘膜固有层的脱离，肠壁中的炎性细胞浸润（图2B）。VEKC组大鼠具有显着改善的肠粘膜组织学结构（图2C）。EKC组肠粘膜损伤评分显着高于C组，VEKC组低于对照组（表2）。

图2. 第7天肠组织的代表性组织病理学图像。

注：A，对照（C组）；B，EK（680mg / Kg）处理的大鼠（EKC组）；C，醋灸EK粉末680mg / Kg（VEKC组）处理的大鼠；原始放大倍数x100；褐色箭头区域代表一个严重的绒毛区域和腺体脱落。

利用抗p65抗体，抗ICAM-1抗体，通过免疫组织化学技术发现，与C组相比，EKC组和VEKC组大鼠小肠组织(NF-κB)p65和ICAM-1表达增加，上皮细胞钙粘蛋白表达下降。与EKC组相比，用VEKC组导致p65和ICAM-1表达显着降低并且E-钙粘蛋白表达增加（P <0.01）。结果显示，用醋灸处理显着降低了p65和ICAM-1表达的增加，并增加了EK诱导的E-钙粘蛋白的减少（图3）。

3.大鼠肝功能及血清氧化损伤指标的变化

与C组相比，EKC组和VEKC组大鼠血清AST（谷草转氨酶）、ALT（谷丙转氨酶）、LDH（乳酸脱氢酶）和MDA（丙二醛）水平显着升高，GSH（谷胱甘肽酶）和SOD（超氧化物歧化酶）活性水平显着降低。结果显示，醋灸显著降低了EK诱导的ALT和AST活性。

图4. EK和VEK对正常大鼠血清肝功能和氧化损伤指标的影响。

4.大鼠肠道微生物群测序深度与α多样性的比较

observed species曲线和Rank-Abundance曲线图表明，每个样本的物种分布均匀，可用于多样性分析。Shannon指数反应了测量物种的均匀度和丰富度。EKC组的Shannon指数值显着高于C和EKC组，VEKC组的Shannon指数值与C组相似。结果表明：EK的毒性可能与微生物多样性的增加有关，VEK的解毒作用可能与微生物多样性的减少有关（图5C）。

图5. EK和VEK对大鼠肠道微生物α多样性的影响。

5.大鼠肠道微生物β多样性与肠道菌群丰度的比较

在该分析中，利用加权的UniFrac距离做了β多样性的分析，考虑了OTU之间的系统发育距离，可以在个体种系的水平和更高的分类学水平上捕获差异。PCA图显示这三组处理可明显区分（图6A）。LDA在三个组之间的微生物组中显示出不同的分类群（图6B）。该分类图表明了各级群体中不同的微生物群落或物种结构。Cladogram结果进一步表明三组之间的不同类别的细菌分别聚类（图6C）。

图6. 比较不同组之间的粪便微生物组。

用EK和EKC处理的大鼠，肠道中有代表性的有益细菌（乳杆菌）的相对丰度降低，而肠刺激相关细菌（Blautia）的相对丰度增加。与EKC组相比，VEKC组显示益生菌乳酸杆菌的相对丰度增加，并且Blautia的相对丰度降低。这些相对丰富的微生物属的热图也显示两种细菌在属水平上是高度表达的细菌。瘤胃球菌属（Ruminococcus）和拟普雷沃菌（Alloprevotella）的相对百分比EKC组中最低，VEKC组中最高（图8）。上述结果表明EK的毒性和VEK的解毒可能与上述这两种细菌属有关。

图7. 在门和属的水平上的肠道微生物群的组成。

图8. 通过16S rDNA基因测序分析的前10个细菌属的热图。

6.EK和VEK对大鼠粪便样品中短链脂肪酸的影响

三组样品中的主要的物质是乙酸，丙酸，丁酸和戊酸，这些物质通过减少趋化因子产生或粘附分子表达来减少肠道炎症。与C组相比，EKC和VEKC组短链脂肪酸的相对浓度显着降低。VEK组相对浓度显着增加。结果显示，醋灸可能与肠道微生物群调节的短链脂肪酸产量显着增加有关。

图9. 通过GC-MS分析大鼠粪便样品对SCFAs进行定量。

讨论

     本研究通过给大鼠口服甘遂和醋灸后甘遂，得到的数据初步阐明了甘遂对肠道毒性作用以及通过醋灸后化学成分的改变和对动物的解毒作用。醋灸可以显著减少甘的十种有毒成分，并且还可以显著降低由组织病理学，肝功能，氧化损伤和炎症损伤评估的肝和肠道毒性。甘遂经醋炙后，主要益生菌比例增加，潜在致病菌减少。事实证明，用醋炙可以达到有效的解毒效果。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378874118304082