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文献解读

集思慧远客户发表《Nrf2和自噬在调节A549细胞系中TLR4-NFκB介导的,由鸡舍PM2.5引起的炎症中的作用》

发布日期:2019-08-08 浏览次数:127

IF: 5.108

摘要

       鸡舍颗粒物(PM)对人和鸡的呼吸健康有不利影响,进一步影响动物性能,降低生产效率。然而,对PM2.5引起的呼吸系统炎症的研究很少,其机制也不清楚。本研究以人腺癌肺泡基底上皮细胞(A549细胞)为研究对象,对PM2.5引起的炎症反应进行研究,探讨Nrf2和自噬在炎症调节中的作用。结果表明,经PM2.5处理后,A549细胞的活力呈时间和浓度依赖性下降。经PM2.5处理12h后的TNFα、IL6和IL8显著增加。RNA测序表明,差异表达的基因在免疫系统过程、氧化应激(OS)、内质网应激(ERS)和自噬中丰富。进一步研究表明,TLR4-NFkB p65信号通路参与了PM2.5引起的炎症反应。Nrf2的过度表达显著降低了TNFα、IL6、IL8的水平以及NFkB p65和NFkB pp65的水平。在PM2.5处理的细胞中,Nrf2的过度活化也限制了OS和ERS。PM2.5诱导的自噬通过增加NFkB p65和NFkB pp65水平促进炎症的发生。自噬缺陷增强了Nrf2的表达。总之,我们的研究显示Nrf2可以防止由鸡舍PM2.5刺激引起的炎症,然而,自噬在TLR4-NFkB p65中起到促进作用,介导A549细胞的炎症。

材料

       材料分为PM2.5采集和A549细胞系(人腺癌肺泡基底上皮细胞)两个部分,这里着重讲一下转录组测序的材料部分:用25μg/ml的PM2.5处理12小时,对A549细胞进行RNA-seq测序分析,测序平台为illumina Hiseq平台,采用PE150测序。

实验结果

1. PM2.5降低细胞活性和诱导炎症响应

       TNFα诱导上皮屏障功能丧失并增强单核细胞的通透性,作为促炎细胞因子促进IL1β、IL6和IL8的分泌,IL1β可激活巨噬细胞和中性粒细胞;IL6可激活中性粒细胞和B淋巴细胞的增殖;IL8是一种趋化因子,可激活中性粒细胞。

       PM2.5处理后的细胞上清液以112 g离心20分钟,用于检测种炎性细胞因子。采用酶联免疫吸附测定试剂盒测定肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素1β(IL1β)、白细胞介素6(IL6)、白细胞介素8(IL8)的水平。

A:MTT法对细胞活性检测

B:酶联免疫吸附法对TNFα、IL1β、IL6和IL8检测


       PM2.5对A549细胞施加了细胞毒性,诱导了TNFα、IL6和IL8的释放,通过这些释放,A549细胞的免疫增强,防御了PM2.5的刺激

2. 转录组分析结果

       用25μg/ml的PM2.5处理12小时,对A549细胞进行RNA-seq测序分析。最终得到557个差异基因,427个上调,130个下调。



A:GO富集图,显示抗氧化还原功能、免疫系统、刺激响应得到显著富集

B:KEGG通路分类图,差异基因在免疫疾病、传染病、免疫系统过程中富集

C:OS、ERS、自噬相关基因热图,重点挑基因,例如和OS相关的LOX、ALOXE3、GPX7、PRDX2、GSTT2B,和ERS相关的ORM2。同时发现SPAAR上调了,而前人研究SPAAR可以负调控mTORC1(雷帕霉素点),促进自噬激活。

3. TLRs-NFκB信号通路调节A549在PM2.5作用下引起的炎症

       Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子,也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。NFκB家族由p60、p52、rela(p65)、c-rel和relb组成。NF-κB是对有害细胞刺激的第一反应者。当细胞受到各种外界因素(包括应激损伤、脂多糖、病毒、氧自由基等)的刺激时,IκB被IκB激酶(IκK)磷酸化,然后将NFκB分离并转移到核中,开始转录。p65有转录激活域调节基因表达阳性,所以接下来将NFκB p65作为对象研究。NFκB pp65是由处于活性状态的NFκB p65的不同丝氨酸位点的磷酸化产生的。

       TLRs-NF-κB信号通路是细胞中广泛存在的信号转导途径,在免疫、炎症、肿瘤等众多疾病的发生发展中起着重要作用。

A:TLRs相关基因RT-PCR表达验证,用25 μg/ml的PM2.5处理12h

B:免疫荧光法检测NFκB pp65的位置,用25 μg/ml的PM2.5处理12h

C:分别在0、3、6、12、24、48 h时,用PM2.5刺激后检测NFκB p65和NFκB pp65


       PM2.5激活了TLRs信号通路,促进TLR、TICAM1、TRAM2的高表达,PM2.5刺激下,NFκB p65和NFκB pp65也被激活了。在PM2.5 处理后NFκB pp65的水平升高。在12h时,NFκB p65和NFκB pp65的水平达到最高,然后同时下降,呈现时间依赖性方式。表明,TLR4-NFκB p65信号在PM2.5处理后被激活,并引起TNFα、IL6和IL8的释放。4. PM2.5对A549细胞中OS和ERS的影响氧化应激(OS)是由高活性分子(如活性氧化物质(ROS))与抗氧化系统在人体受到各种有害刺激时的清除率之间的不平衡造成的。内质网应激(ERS)是一种对氧化应激、缺血、营养不良、病毒感染引起的应激的保护性反应,其过程可以减少未折叠蛋白的异常积累,保持细胞的稳态。ERS是通过折叠蛋白和错误折叠蛋白的积累以及内质网中的钙丢失或钙超载来实现的。GRP78和活性转录因子6(ATF6)是ERS的关键调节因子,其功能涉及蛋白质的正确折叠和组装。CHOP是ATF6的下游基因,涉及ERS引起的凋亡和炎症。

       活性氧(ROS)检测、钙离子(Ca2+)检测和RT-PCR及western blot。

A:共聚焦显微镜观察PM2.5处理后的ROS含量增加

B:共聚焦显微镜观察PM2.5处理后的Ca2+含量增加

C:和OS和ERS相关基因的RT-PCR表达验证,大部分与RNA-seq一致

D:免疫印迹法检测GRP78和CHOP在PM2.5处理后的表达

       PM2.5刺激增加了细胞内的的Ca2+,RT-PCR显示ORM2和CHOP显著升高,与RNA-seq结果一致。GRP78的表达呈上升趋势,ATF6下降。PM2.5处理诱导的GRP78和CHOP在前12小时逐渐升高,在24小时和48小时下降。,CHOP的表达与PM2.5处理后12小时ATF6的表达不一致。尽管CHOP水平在12小时内逐渐升高,但在24小时和48小时下降,显示时间依赖性方式。ATF6在12h表达呈下降趋势,可能导致24h CHOP表达下降。

5. Nrf2在降低PM2.5引起的A549细胞炎症中的作用

       Nrf2作为转录因子可在氧化应激(OS)中被激活。Nrf2调节下游抗氧化基因表达,在保护细胞免受亲电细胞、氧化剂和异物的损害方面发挥着重要的作用。

       PM2.5处理后采用荧光免疫组化、western blot实验检测Nrf2的表达变化,过表达Nrf2实验检测炎症因子的表达变化,基因沉默Nrf2检测NFkB表达变化。


A:免疫荧光法检测PM2.5处理后Nrf2的表达增加。

B:免疫印迹法检测PM2.5处理后Nrf2的表达先升后降,时间依赖降低。

C:免疫印迹法检测细胞质和细胞核在PM2.5和TBHQ(叔丁基对苯二酚,抗氧化)处理后Nrf2的表达

D:过表达Nrf2,检测TNFα, IL6, IL8的含量增加

E:RNA干扰Nrf2后,检测NFkB p65、NFkB pp65的变化

6. Nrf2在抑制PM2.5引起A549细胞中的OS和ERS

       荧光检测ROS和Ca2+,基因沉默Nrf2后检测CHOP和GRP78。


A:共聚焦显微镜观察过活化Nrf2后细胞内ROS的含量增加

B:共聚焦显微镜观察过活化Nrf2后细胞内Ca2+的含量增加

C:RNA干扰Nrf2后,检测CHOP和GRP78含量的降低

7. PM2.5诱导细胞自噬

       自噬作为一个重要的病理和生理保守过程,可以将蛋白质、糖原、脂类、核苷酸、其他大分子和细胞器分离到自噬体中,并转运到溶酶体中进行降解,以维持细胞的更新和稳态。SPAAR可以负调控mTORC1(雷帕霉素靶点),促进自噬激活。ATG(autophagy-related protein)就是和自噬相关的基因。LAMP2(lysosomal associated membrane protein)是溶酶体相关蛋白,LC(microtubule - associated protein light chain),也是一种自噬相关蛋白。BECN1也是一种公认的自噬相关蛋白。


A:自噬相关基因的RT-PCR表达验证

B:免疫印迹法检测BECN1、LC3II、ATG7和LAMP2在PM2.5处理后0、3、6、12、24、48小时的表达。

C:共聚焦显微镜下免疫荧光检测LC3的点状结构

D:透射电镜检测在PM2.5处理后0、3、6、12、24、48小时后自噬体的积累,箭头为自噬体

8. 自噬缺陷对NFκB p65、NFκB pp65和Nrf2表达的影响

       本试验采用ATG7-sirna处理细胞6小时,以阻断ATG7的表达,然后去除培养基进行以下分析。

       ATG7缺陷下调了NFκB p65和NFκB pp65,表明由PM2.5引起的自噬促进了PM2.5介导的A549细胞的炎症。此外,自噬缺陷对用PM2.5处理的sirna-ATG7的Nrf2表达有积极影响。

结论

       1、PM2.5降低了A549细胞的活性并诱导炎症。

       2、TLR4-NFκB信号通路参与了A549细胞PM2.5诱导的炎症反应。

       3、Nrf2通过抑制OS和ERS降低PM2.5诱导的炎症。

       4、自噬通过增强NFκB p65和NFκB pp65的表达来促进PM2.5诱导的炎症。