水稻叶绿体蛋白质组和细胞代谢组学特征的脱水反应改变揭示了关键的应激适应反应

发表期刊：Environmental and Experimental Botany

影响因子：IF=3.712

摘要

叶绿体是植物和其他光合真核生物中的一种半自治细胞器，在调节光合作用中起着基础性作用。它还负责维持必需的生物合成反应，包括氨基酸，脂肪酸和萜烯的合成。光合作用，光能转化为化学能，用作环境变化的传感器，并增强不同的细胞功能，以启动适应性反应。然而，叶绿体所采用的脱水耐受性的分子过程和调控机制仍在很大程度上是未知的。为了更好地理解脱水反应，开发了水稻叶绿体蛋白质组图谱。对4周龄水稻幼苗进行9天保水脱水，监测脱水对叶绿体的损伤程度。iTRAQ的定量蛋白质组分析导致了40种差异调节蛋白(DRPs)的鉴定。DRPs可能参与了大量的代谢过程，包括叶绿体能量代谢、光合作用和防御反应。此外，脱水导致代谢物分布和网络分析的变化揭示了支链氨基酸和糖的高丰度，可能降低渗透电位，从而保护细胞完整性。蛋白质组学方法揭示了主要光合作用相关蛋白的状态改变，而细胞代谢物谱显示了三羧酸循环中间产物的改变，表明脱水引发了ATP产生和能量代谢的改变。总之，这些结果表明，叶绿体蛋白质组的全球调控与适应性反应的细胞代谢重组密切相关，这可能有利于作物品种的遗传调控，以获得更好的适应性。

1、引言

缺水或脱水是全球农作物生产和粮食安全的主要制约因素，由于全球气候的快速变化，近年来这一问题逐渐加剧。与任何其他环境因素相比，脱水严重限制了植物的生长，降低了粮食产量。显然，脱水继续对现代农业构成重大威胁。对脱水的适应性反应是一个复杂的生物学过程，涉及生理和分子水平的变化。脱水对植物生长和产量的影响取决于基因型、发育阶段和程度以及胁迫持续时间。因此，了解植物适应脱水的复杂分子机制对于在缺水条件下增加植物生长和生产力是至关重要的。

叶绿体是一种半自主的细胞器，它拥有产生减少ATP生产能力的光合装置。此外，它在包括氨基酸代谢，脂肪酸和多种次生代谢物的生物合成在内的许多细胞功能中起中心作用。叶绿体轨迹的演变回到其蓝藻的起源和共生结合到光合真核生物的细胞环境中。成熟的叶绿体含有3000多个具有多种功能的蛋白质。大多数叶绿体蛋白在细胞质中合成并通过精心安排的传输系统传输到叶绿体中。然而，许多关键蛋白质由叶绿体基因组编码，特别是涉及光合作用和其他代谢过程的蛋白质。在叶绿体内执行一个复杂的信号通路网络，在各种环境刺激下产生活性氧(ROS)。叶绿体类囊体中的反应中心，特别是PSI和PSII，被认为是调节质体氧化还原状态、代谢活性和核基因表达的活性氧的主要来源。因此，更好地了解叶绿体对植物生存、发育和繁殖有实际意义。

在过去的十年中，在理解高等植物（包括拟南芥）叶绿体蛋白质组对盐度、光照、黑暗、臭氧消耗、缺铁、冰冻、干旱和原生质体的反应方面取得了重大进展。然而，脱水的影响仅限于高羊茅、小麦、玉米、烟草和番茄，其生长发育不受缺水条件的影响。在不同作物的文献中报道了脱水的可变效应，所述不同作物是高度物种特异性的。值得注意的是，叶绿体对影响核心碳和能量代谢的脱水高度敏感，而核心碳和能量代谢是植物生长的关键决定因素。在脱水情况下，由于气孔关闭，二氧化碳的供应减少，从而减少了类囊体反应产生的ATP和NADPH的消耗。因此，叶绿体与脱水反应密切相关，可作为了解脱水触发氧化还原信号机制的极好的模型细胞器。

大米是世界上最重要的谷物作物，它是世界上一半以上人口的主食。它需要大量的水，大约是种植其他谷物所需水量的2.5倍，这表明了大米和水这两种世界上最珍贵的商品之间的密切关系。因此，脱水对可持续的稻米生产构成了主要威胁。为了了解叶绿体，特别是蛋白质组分如何适应脱水，采用同重标记相对和绝对定量（iTRAQ）方法对水稻进行了叶绿体蛋白质组分析。估计叶绿体蛋白质组谱的这些变化将有助于理解其中进行的途径的变化。此外，由于叶绿体是碳水化合物、脂类和氨基酸的生物合成位点，因此，有必要测定细胞代谢产物的总体变化对这种变化的反应。通过比较蛋白质组分析，确定了40个差异调节蛋白(DRPs)，这些蛋白质可能参与了复杂的信号传递过程。我们还结合蛋白质组学和代谢组学途径验证了这些发现，并提供了适应性反应的全面概述。这可能有助于叶绿体基因工程，该基因工程可用于生产具有气候抗御能力的作物。

2、材料与方法

2.1、幼苗生长与胁迫处理

耐受相对脱水的水稻（Oryza sativa L.var.Rasi）的幼苗在5.6升的盆（10株幼苗/盆）中生长，盆中含有土壤和土壤的混合物（2：1，重量/重量）；pH 5.5-6.8。每天给盆栽500ml水，使土壤水分保持在70%左右。生长室内温度为28±2°C，相对湿度为70±5%，光周期为16h(光照强度为300μm^-2s^-1)。对4周龄水稻幼苗进行脱水，保持水分。采用烘箱干燥法测定了非胁迫和9d脱水条件下土壤水分含量。为了分离叶绿体和随后的蛋白质组学分析，在未干燥和9d脱水条件下收获幼苗的地上部分。对未胁迫和3d、6d和9d脱水幼苗的地上部分进行代谢物分析。除另有说明外，将收获的组织立即冷冻在液氮中，然后在−80°C保存。

2.2、物理化学分析

利用光合作用系统测定了水稻幼苗的光合速率、气孔导度和细胞间CO₂浓度。叶腔内CO₂浓度的控制采用CO₂柱，固定流速为500μmol s^-1。室内参考CO₂浓度固定在355个μmol mol^-1，这是前室条件下大气CO₂水平的平均值。室内温度保持在25°C，光照强度为1750μm^-2 s^-1光合光子通量密度(PPFD)，约占太阳光的87.5%。使用2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）荧光染料确定叶子的H₂O₂含量。如前所述测量丙二醛（MDA）和脯氨酸的丰度。

2.3、透射电镜

收获非胁迫对照和9-d脱水幼苗的地上部分并快速转移到固定溶液中（0.2M二甲胂酸盐缓冲液，pH7.1，含2％戊二醛）在25℃下过夜。样品被嵌在树脂块中，用Leica EM UC6超微电脑进行切片。将切片安装在铜涂覆的网格上，并使用低温透射电子显微镜JEM-2100F观察。

2.4、叶绿体的分离、蛋白质提取和纯度鉴定

通过上文描述的方法分离叶绿体，并稍作修改。将约50g组织在200mL冰冷的叶绿体分离缓冲液（CIB）缓冲液[50mM HEPES-KOH（pH 8.0），330mM山梨糖醇，2mM EDTA，5mM抗坏血酸，5mM半胱氨酸和0.03％BSA]中均质化。将匀浆通过两层滤布并在4°C下200×g离心3min以除去细胞碎片。上清液转入新鲜试管，1000×g离心7min，制成叶绿体颗粒，悬浮于1mL CIB中。经1700×g离心6min，在40% Percoll分层液上恢复完整的叶绿体。叶绿体在试管底部沉淀，在培养上清液中留下破碎的叶绿体，被移液管移除，而不干扰颗粒。用细刷将沉淀重悬于2ml不含BSA的CIB(叶绿体洗涤缓冲液，CWB)中。将完整叶绿体的沉淀用CWB以1000×g洗涤3min并重复3次。通过用0.9％NaCl洗涤颗粒也可以去除渗透污染。通过用冷却的丙酮处理分离叶绿体蛋白，在-80℃下储存过夜，并在20,000×g离心15min沉淀。用水浴超声仪将蛋白颗粒再悬浮于7M尿素中。用3kDa的柱将尿素用0.5M三乙基胺碳酸氢盐(TEAB)缓冲液交换。用BCA蛋白估计试剂盒测定叶绿体富集蛋白的浓度。为了评估叶绿体蛋白的纯度，使用50μg叶绿体和全细胞蛋白进行免疫印迹分析，并在12.5％SDS-PAGE上分离，并在150mA下电转移到硝酸纤维素膜（GE Healthcare）上2h。用3%（w/v）BSA阻断这些印迹，并用抗LHC II（采光复合物II，Agrisera A S01 003）、抗CPN60（伴侣蛋白60，Agrisera A S12 2613）、抗COX II（细胞色素氧化酶II，Agrisera A S04 053 A）和抗V-ATPase（液泡ATPase，Agrisera A S07 213）单独培养抗体。建议稀释的初级抗体是按照制造商的指示使用的。通过与增强的化学发光（ECL）底物一起温育，在X射线胶片上检测信号。另外，如前所述，通过测定叶绿素和细胞质酶（UGPase）活性来检查富含叶绿体的组分的纯度。

2.5、蛋白组学分析

使用3kDa截留柱，通过0.1M TEAB缓冲液对叶绿体蛋白进行缓冲液交换。

样品用量：60μg；

样品处理：iTRAQ 4-plex；分别用114、116、115和117个iTRAQ标签标记非胁迫对照和经9d脱水处理的蛋白质样品。

检测平台：Eksigent NanoLC-Ultra 2D plus-TripleTOF 5600(AB Sciex) system。

数据库选择：NCBI水稻数据库

差异蛋白质：利用群体统计数据对鉴定出的叶绿体蛋白质进行严格筛选，以确定在脱水条件下发生显著变化的DRPs。根据88%覆盖率的变化，确定了鉴定蛋白的fold cut-off value。在两个生物学重复中，变异率超过50%的蛋白质没有考虑进一步分析。在两个重复中表现出一致上调或下调的蛋白质被认为是DRPs。

2.6、生物信息学分析

用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)检测DRPs的跨膜结构域预测数。使用Expasy服务器（http://au.expasy.org/tools/protparam.html）上提供的ProtParam工具计算每个DRP的亲水性（GRAVY）值的平均值。利用ExPASy(http://web.expasy.org/_pi/)的计算工具计算了DRPs的分子量(MW)和等电点(PI)。为了确认所鉴定的DRPs确实是叶绿体，使用五种不同的开源软件对蛋白质序列进行计算机模拟预测分析。

ChloroP(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)；

TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)；

ngLOC(http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html)；

WoLF PSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)；

Predotors(https://urgi.versailles.inra.fr/predotar/)。

使用基本版本的软件，通过Blast2Go分析对DRP进行分类。DRPs的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络由STRING软件v.10.5（https://string-db.org/）进行。分析中考虑了显著的E值，并以水稻为模型生物。

2.7、RNA提取及qRT-PCR分析

采用氯化锂法提取无胁迫对照和9d脱水水稻幼苗总RNA。使用VersocDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.)和1μg RNA进行逆转录反应。在ABI Prism 7700检测系统(应用生物系统，CA，美国)中，利用Power SYBR绿色PCR对转录本进行了qPCR分析。与基因特异性引物混合的主混合物，和用作内部对照的β-微管蛋白。

2.8、GC-MS代谢谱分析

这些代谢物是从非胁迫对照的地上部分和3d、6d和9d脱水幼苗中提取的，然后如前面所述进行衍生化处理。

检测平台：GC–MS (Shimadzu QP-2010)；

扫描范围：40-650Da；

2.9、统计分析

采用单因素方差分析（ANOVA）和邓肯多程检验（DMRT）对采集的数据进行了图形和统计分析，使用GraphPad Prism v 7.00来推断显著差异（*p<0.05，*p<0.01）。

3、结果

3.1、脱水诱导水稻幼苗生理生化变化的研究

植物的应激反应在很大程度上取决于胁迫暴露的强度和持续时间以及作物生长的阶段。为了评价其适应性反应，对发育（4周龄）的幼苗进行9d保水脱水，并监测其理化性状的变化。苗木在脱水初期（达3d）无胁迫迹象，但在9-d脱水时叶片卷曲下垂（图1A），土壤含水量急剧下降（图1B）。通过分析细胞内H₂O₂、MDA和脯氨酸含量的变化，探讨形态计量学性状的变化与生化指标的关系。细胞内H₂O₂（图1C）和MDA（图1D）的含量增加，与水分充足的无压力幼苗相比，9-d脱水时的含量增加了2.38倍。高浓度的H₂O₂，从0.277±0.03RFU/μg到1.26±0.27RFU/μg，脱水后9天处理表明活性氧ROS的产生增加。值得注意的是，叶绿体和线粒体是产生活性氧的主要场所，在应激条件下容易受到损害。正如预期的那样，我们观察到大量的脯氨酸(图1E)，这可能是幼苗保持水分的预防措施。脯氨酸被认为可以作为抗氧化剂，因此脱水下脯氨酸含量较高可能是限制电解质渗漏和脂质过氧化的适应性反应。脱水条件下幼苗净光合速率从10.16±0.92μmol CO₂ m^-2s^-1下降到1.23±0.37μmol CO₂ m^-2s^-1（图1F），这可能与气孔导度的降低有关。气孔导度由0.2 8±0.01mol H₂O m^-2s^-1降至0.0 6±0.01mol H₂O m^-2s^-1(图1G)。众所周知，气孔导度可以在严重脱水时改变植物的水分利用效率(WUE)和光合作用。同时，我们观察到脱水诱导的叶绿体超微结构的改变。在未加压的细胞中，叶绿体呈椭圆形或心轴状，含有白色淀粉颗粒，位于细胞壁附近。然而，在9d脱水时，叶绿体膨大，没有淀粉颗粒，并从细胞壁移位(图1H，I)。

Fig. 1. Morphological and physiological changes observed in 4-week-old rice seedlings in response to dehydration.

图1 4周龄水稻幼苗对脱水反应的形态学和生理变化

注：(A)在对照和脱水(处理)条件下的水稻幼苗的形态。（B）脱水引起的土壤水分含量下降（SMC），（C）H₂O₂形成增加，（D）MDA产量和（E）水稻叶片中的脯氨酸含量。由便携式光合作用系统(Li-6400XT)测定的对照和脱水叶片的(F)光合速率和(G)气孔导度的估计。所有值均为三重值(n=3)，以平均±标准误差(SE)表示。a、b字母差异有统计学意义(P<0.05)。(H，I)透射电镜观察对照和脱水叶片叶绿体超微结构。

3.2、叶绿体完整性和叶绿体蛋白纯度评估

亚细胞分级分离和蛋白质富集对于细胞器蛋白质组研究的准确性至关重要。因此，在蛋白质组学分析之前，通过使用针对不同细胞器特异性蛋白质的抗体的免疫印迹分析来检查叶绿体富集级分的纯度。与总细胞提取物(图2A)相比，类囊体膜局部集光复合物II(LHCII)和伴侣蛋白-60(CPN60)显著富集。在分离的叶绿体中，线粒体特异性抗COXII和液泡抗V-ATP酶蛋白的检测可忽略不计，进一步证实了其纯度。含有破碎叶绿体的细胞提取物的叶绿素含量明显高于完整叶绿体的分离部分(图2B)。用UGPase酶活法测定细胞质污染，发现叶绿体富集组分相对于总细胞提取物的活性微乎其微(如图2C所示)。免疫印迹分析和酶分析证实叶绿体特异性蛋白明显富集，其他细胞器污染的痕迹可以忽略不计。

Fig. 2. Purity assessment of the isolated chloroplast fraction and protein identififications.

图2分离叶绿体部分和蛋白质鉴定的纯度评估

注：（A）在12.5％SDS-PAGE上分离等量的总的和叶绿体部分，并分别使用针对叶绿体标记物LHC II，CPN 60和线粒体以及塑性标记物COX II和V-ATP酶的抗体进行免疫印迹分析。(B)叶绿素含量和(C)细胞质酶UGPase活性在细胞总裂解液和完整叶绿体部分中的估计。数据被表示为平均±标准误差(SE)。无胁迫幼苗变化的统计意义由星号(*p,0.05;**p,0.01)表示。（D）叶绿体蛋白的数量相对于响应脱水胁迫的重复之间的百分比变化的说明。(E)使用基于iTRAQ的蛋白质组学方法量化的DRPs的对数转换比率的分布。在Y轴上绘制DRPs的转换值。

3.3、叶绿体蛋白质组的脱水反应改变

为了研究叶绿体蛋白质组脱水反应的动态，我们对非胁迫对照的叶绿体蛋白和具有两个生物重复的9-d脱水幼苗进行基于iTRAQ的定量分析。用1.3倍的截止值对已识别的一组蛋白质进行统计分析（图2D），得到大约40个DRPs。其中15种蛋白被上调(fold value>1.3)，25种蛋白被下调(fold value<0.76)(图2E和补充表S2)。基于序列的分析表明，所有识别的DRPs都是由核基因组编码的。上调的DRPs包括叶绿素A-B结合蛋白、光系统II 44kDa反应中心蛋白、光系统II D2蛋白和光系统Q等。PSBP、光系统II 10kDa多肽和ATP合成酶的不同亚基均为下调的DRPs。为了全面了解已鉴定的DRPs，对其氨基酸序列进行了不同的生物信息学分析。DRPs是根据它们的GRAVY值分布的(图3A)，表示它们的极性。DRPs的预测分子量为10~150kDa，最大蛋白质分子量范围为10~50kDa(图3B)。根据它们在pH4.0至12.0范围内预测的PI分布分布所识别的DRPs，揭示了在pH5.0至6.0范围内的蛋白质数量最大（图3C）。为了证实DRPs确实是属于叶绿体，我们用不同的算法对蛋白质序列进行了生物信息学预测。分析揭示了相对大量的非重叠结果（图3D），可能是因为每个软件利用不同的算法进行亚细胞预测。补充表S3显示了每一次生物信息学预测的结果。值得注意的是，ngLOC和WoLF PSORT的联合结果分别预测了57.5和75.0％的蛋白质分别是属于叶绿体（图3D）。40种蛋白质中有32种(占DRPs的80.0%)至少用一个预测软件预测为叶绿体蛋白，而55.0%的DRPs由两个或更多的程序预测。尽管关于预测程序准确性的争论还在继续，但总的来说，这些结果表明大多数DRPs都是叶绿体定位的。为了进一步将蛋白质丰度的变化与其相应的转录物丰度相关联，对14个随机选择的DRPs进行定量实时PCR，并比较它们在非胁迫对照和9-d脱水状态之间的转录本丰度。总之，在脱水时的mRNA水平上发现4个基因被上调，7个被下调，这与它们的蛋白质表达谱一致，而3个表现出反比关系（图4）。

Fig. 3. In silico analysis of the identifified difffferentially expressed chloroplast proteins.

图3叶绿体蛋白的差异分析

注：以（A）GRAVY值，（B）分子量和（C）PI表示已鉴定DRPs理化性质的条形图。(D)使用五种不同的软件(TargetP、ChlorP、ngLOC、Predotar和WoLF PSORT)对已识别的DRPs进行基于序列的定位预测。

Table 1 List of identied DRPs in response to dehydration stress.

表1响应脱水胁迫的差异蛋白质列表

Fig. 4. Relative mRNA abundance of 14 randomly selected DRPs.

图4 随机选取的14个DRPs的相对mRNA丰度

注：从非胁迫对照和9d脱水水稻幼苗的mRNA中提取cDNA.表达水平以β-微管蛋白作为内源性对照。相对转录丰度用三个独立样本的平均数表示。星号与丰水对照比较有显著性差异(∗p<0.05和*P<0.01)。

3.4、基于基因本体论的DRPs分类

对已鉴定的DRPs进行Bast2GO分析，以确定其与分子功能和生物学过程的关系。DRPs根据其与生物过程的关联分为10组，包括代谢过程，对刺激的反应，生物调节，发育过程，对非生物刺激的反应等（图5A）。基于分子功能的分类分为3组，包括蛋白质结合、催化和转运蛋白活性（图5B）。此外，基于京都基因和基因组百科全书(KEGG)数据库，对DRPs的路径注释进行了分析。分析表明，DRPs被富集为13条途径。值得注意的是，在已鉴定的与乙醛和二羧酸代谢相关的DRPs酶中，嘌呤代谢、氧化磷酸化、果糖代谢和光合作用均受到脱水的显著调节（图5C）。

Fig. 5. Gene ontology (GO) based classifification of the difffferentially expressed chloroplast proteins.

图5基于基因本体(GO)的差异表达叶绿体蛋白的分类

注：针对NCBInr蛋白质数据库搜索DRPs序列并将其导入Blast2GO软件以用于GO术语映射和注释。鉴定的DRPs（A）生物过程，（B）分子功能和（C）KEGG途径的二级分类。

3.5、DRPs的蛋白质互作网络

为了研究水稻叶绿体DRPs是如何通过蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)传递脱水信号的，我们利用STRING数据库研究了它们之间的潜在相互作用。PPI网络由43个节点和111个边缘组成。不同的颜色表明参与生物功能的DRPs之间的相互作用，例如蛋白质合成，能量过程，光合作用，碳水化合物代谢和代谢过程（图6）。虽然预测的相互作用网络需要实验验证，但这些结果代表了叶绿体对脱水反应的PPIs的一小部分。此外，它强调，几个相互作用的DRPs可以调节在叶绿体内执行的相应途径中的脱水反应移位。

Fig. 6. Protein-protein interaction network indicating dehydration-induced alterations in chloroplastic pathways.

图6蛋白质-蛋白质相互作用网络显示脱水诱导的叶绿体途径的改变

注：圆代表同一生物过程中蛋白质之间的相互作用。较大的节点表示较多的交互作用，较小的节点表示较少的交互作用。颜色和边缘厚度表示交互作用的程度。边缘的黑色表示共表达，绿色代表实验确定。厚边表示强交互，薄边表示弱交互（为了解释本图图例中的颜色参考，读者可以参考本文的Web版本）。彩色节点：查询蛋白质和第一个互作的蛋白质；白色节点：第二个互作的蛋白质；空节点：未知三维结构的蛋白质；填充节点：一些3D结构是已知或预测的；

3.6、叶绿体DRPs的比较分析

为了识别与前面报道的应激反应叶绿体蛋白质组的独特和重叠的DRPs，利用单个胁迫报道中的编码蛋白数据库对氨基酸序列进行了BLAST分析，包括脱水、盐度、光、缺铁、臭氧消耗和冷冻(补充表S5)。基于序列的BLAST分析显示16个DRPs与先前报道的应激反应叶绿体蛋白质组重叠(图7A)。此外，分析显示60%的DRPs是脱水反应特有的，而剩余的与其他压力反应重叠(图7B)。在水分亏缺胁迫下，重叠数最大(14)。令人惊讶的是，第二大重叠是缺铁，其次是盐度和光照。ATP合成酶β亚基在所有报道中都很常见。叶绿素A-B结合蛋白是在水分亏缺、冷冻、盐度和缺铁条件下鉴定的。比较蛋白质组学分析将有助于确定各种胁迫反应的独特和共有成分。这表明，对胁迫敏感的叶绿体蛋白的比较分析可用于选择性地鉴定具有相对应急耐受性的元素。

Fig. 7. Comparative analysis of the identifified DRPs with previously reported stress inducible chloroplast proteins.

图7已鉴定的DRPS与先前报道的应激可诱导叶绿体蛋白的比较分析

注：（A）脱水反应性DRPs（红色）与其他应激（蓝色）报告的重叠次数。（B）在其他压力下确定的DRPs百分比。（有关此图例中对颜色的引用的解释，读者可参考本文的Web版本）。

3.7、非靶向代谢物谱揭示了路径紊乱

为了确定脱水引起的叶绿体蛋白质组的变化是否也反映了细胞代谢物的含量，我们分别对无胁迫对照、3d、6d和9d脱水水稻幼苗进行了非靶向代谢组分析。除几种次生代谢物外，氨基酸、脂类、碳水化合物等代谢产物差异显著。在脱水初期(3d)，除L-天冬酰胺含量急剧增加(17倍)外，差异无显著性。长期脱水后，天冬氨酸、缬氨酸、γ-氨基丁酸GABA、异亮氨酸、正缬氨酸、脯氨酸和苏氨酸等氨基酸的积累显著增加，而谷氨酸浓度降低(图8A)。在碳水化合物如葡萄糖醇，甘露糖和肌醇中检测到丰度的适度增加，而在葡萄糖酸，塔格糖和木糖的浓度中观察到急剧增加。除氨基酸和糖分子外，TCA循环中的有机酸中间体也受到脱水的影响(图8B)。当苹果酸和草酸的丰度降低时，丙二酸和琥珀酸的含量保持在相对恒定的水平。在脱水处理的早期阶段，磷酸和苯丙醇胺的丰度发生了巨大的降低，而发现2-丙烷和乙醇胺的含量一直增加（图8A）。

Fig. 8. Dehydration-induced changes in intracellular metabolite contents.

图8脱水引起的细胞内代谢物含量的变化

注：通过GC-MS分析估计代谢物，并将个体代谢物标准化为内标核糖醇。值表示标准化代谢物相对于三个生物学重复样品的内部控制的平均比率。(A)绿色代表最高丰度，红色代表最低丰度。以粗体表示的fold值有统计学意义(≤0.05)。通过Student's t检验测试跨时间点的代谢特征的显著差异。(B)受代谢产物含量变化影响的途径。绿色表示上调的代谢产物（用于解释该图图例中颜色的参考，读者参考本文的Web版本）。

总结

本研究探讨了脱水对世界上栽培最多的水稻叶绿体蛋白质组规模的影响。比较蛋白质组学分析表明，脱水诱导的反应通过调节与以下相关的蛋白质来显著影响叶绿体功能：(i)碳水化合物代谢，(ii)光合作用，(iii)蛋白质合成和降解，和(iv)能量过程。在这些途径中，涉及光合作用的蛋白质大部分在长时间脱水下被调节。此外，代谢产物分析显示游离氨基酸丰度增加，可能与胁迫耐受相关。我们的研究表明，应激反应的叶绿体蛋白如PsbP、HAD超家族磷酸酶和IM30蛋白具有很强的调节作用。许多DRPs的确切作用目前尚不清楚，因此它们的功能表征将提供更多有关压力适应的见解，并有助于开发适应气候变化的作物。

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