【文献解读】利用BSA-seq技术定位辣椒果色候选基因PRR2
发布日期：2020-07-28 浏览次数：4628
利用BSA-seq技术定位辣椒果色候选基因PRR2
期刊：Theoretical and Applied Genetics IF=4.561
背景
c1、c2和y位点作为决定胡椒成熟果实颜色的基因已被广泛报道，然而c1可能会影响红色、橙色和黄色果实的色素沉着减少的研究还不清晰。在辣椒品种Habanero中两个桃红色和橙色的品种发生了c2突变，并在F2群体中可与c1位点分离。为了鉴定c1位点的基因组区域，我们在橙色和桃红色杂交产生的F2群体上采用了扩增分离分析和基因分型测序相结合的方法，定位到候选基因PRR2。
材料方法
1.国内辣椒品种：Habanero Orange（HO，橙色）╳Habanero Peach(HP桃红色)得到381株F2群体。
国外辣椒品种：C. annuum ‘IT158782（白色）
2.BSA-seq：F2群体中筛选20株橙色个体，25株桃红色个体建立两个极端混池，分别等量混匀其DNA。 GBS：供试材料为：两亲本及两个极端池，基因组DNA约为50ng/1mol illumina HiSeq 2500
3.功能验证及生理分析：基因克隆和测序，qRT-PCR分析，dCAPS标记；高效液相色谱分析，可溶性固形物分析，透射电子显微镜
结果与分析
1. 果实颜色的遗传
在F2群体中，桃红色为隐性性状， F2群体中未成熟果实的颜色与成熟果实的颜色密切相关，表明该基因同时控制着未成熟和成熟果实的颜色。
2. 质体结构与色素变异
利用透射电镜分析HO和HP果实与叶片的叶绿体超微结构及色素表达水平发现，在HP未成熟和成熟果实中，叶绿素、类胡萝卜素、辣椒红素和总可溶性固形物含量均比HO降低；而叶片中叶绿素和类胡萝卜素水平HP与HO之间无显著差异，说明HP色素变异是果实特有的。
3. 叶绿素和类胡萝卜素生物合成基因的qRT - PCR表达分析
基因表达的变化可以调节色素的积累。对HO和HP中叶绿素和类胡萝卜素生物合成基因的表达进行了qRT-PCR检测发现，HP的成熟果实中除β -胡萝卜素去饱和酶和非血红素胡萝卜素羟化酶外，类胡萝卜素生物合成基因的表达显著下调。表明HP中的c1基因位点可能影响叶绿素和类胡萝卜素生物合成基因的转录调控。
4.基于GBS的BSA - seq快速定位c1基因并通过DNA标记验证SNP
通过GBS进行BSA-seq定位HP中的c1位点。以HO基因组为参考，对OB和PB池进行snp –index的计算及绘图。在HP和PB中，推断与桃红色有因果关系或紧密联系的SNPs的SNP-index接近1，在OB中小于0.5。然而，在两组数据中无关联的SNPs的SNP-index都接近0.5。基于这些假设, 在四条染色体上的十一个SNP的Δ(SNP-index)值均超过0.6，被选为c1位点的候选基因组区域。
将SNP转换为CAPS或dCAPS标记以确定其与F2群体表型的遗传关联。其中，SNP chr1-2定位于1号染色体的20026738 bp，其dCAPS与F2群体中的果实颜色共分离。
5. Chr1上c1候选基因的鉴定
在SNP位点附近找到一个距离最近的基因Pseudo-Response Regulator 2 (PRR2)，对其基因组DNA和cDNA进行测序，发现在CcPRR2的第三外显子和第三内含子的交界处，HP缺失了41 bp，导致终止密码子过早出现（C）。CcPRR2在HO中氨基酸长度为587a.a，在HP中为93a.a（d），说明HP中CcPRR2基因可能影响基因功能。
在SNPs的基础上，开发了CcPRR2的CAP标记，且标记与F2群体果实颜色性状发生共分离（b）。所有桃红色F2个体均具有ccprr2 / ccprr2基因型，而所有橙色或浅橙色的F2个体均具有CcPRR2 / CcPRR2或CcPRR2 / ccprr2基因型。即HO包含C1c2Y，HP包含c1c2Y，且在F2群体中只有c1位点发生分离。因此，CcPRR2可能是HP中桃红果色的遗传决定因素以及辣椒中c1位点的候选基因。
6. 种质中psy1，ccs，caprr2基因的突变表现为白色成熟果色
c1c2y基因型在成熟果实中呈白色。在成熟果实呈白色的IT158782中，通过删除PSY1和CCS的启动子和编码区序列，研究CaPRR2的遗传变异及色素含量的表达发现，由于PSY1和CCS仅在成熟果实中表达，且与叶绿素生物合成无关，因此该品系中可能存在影响未成熟果实叶绿素积累的其他遗传变异，且IT231186可能含有c1突变。
综上所述，我们利用基于GBS的BSA-seq方法鉴定了CaPRR2为c1的候选基因。CaPRR2与质体的发育和色素的生物合成有关，进而控制辣椒果实的颜色。
总结：该基因定位的实验设计包括：GBS based-BSAseq +Gene Clone+qRT –PCR+TEM等分子实验技术及生理检测实验技术快速确定了候选基因。其中，BSA-seq与GBS测序的结合可以有效地缩短种群基因型定位所需的时间。
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