全长转录组Iso-seq应用案例解析：多组学贯穿分析

       基于PacBio长读长测序技术的三代全长转录组(Iso-Seq)，不需要对RNA进行打断拼接，可直接获得完整的全长转录本，避免二代测序数据的拼接错误，在基因结构方面的研究有着无可比拟的优势：像剪接异构体、可变多聚腺苷酸化、基因融合研究；另外还有非编码RNA和基因家族等等。

       天气炎热，但小伙伴们对全长转录组的研究却更加火热，如果你早已走在科学研究的前沿，可能早已开始测全长转录组，那么困惑你的是否是如何才能提升研究的深度，提高文章的水平。

       要达到这个目的，还是离不开“多组学贯穿分析”的思路，因为生物体内的机制调控是多水平的，基因组、转录组、蛋白组、表观组等多个水平都是关联的，共同调控生命活动过程。全长转录组数据同样可以与其他组学数据联合研究的，今天我们着重看看几篇案例，给大家提供研究思路。

【三代全长+二代测序+甲基化】

       在2017年《New Phytologist》发表的研究异源四倍体海岛棉纤维发育过程中的可变剪切调控机制。利用iso-seq测序技术超长读长的优势，揭示了海岛棉两套亚基因组部分同源基因的isoforms存在差异，为多倍体物种可变剪接事件的研究提供了新的思路。并联合miRNA数据和DNA甲基化数据来深入研究纤维发育过程中可变剪切调控的机制。

       联合miRNA测序数据，结果揭示海岛棉纤维发育不同时期的转录本可以通过获得或缺失miRNA靶标位点的方式进行调控。表明miRNA数据能与可变剪切研究相结合，从isoform水平诠释基因表达调控的分子机制。

       联合DNA甲基化测序数据，结果揭示核小体占有和DNA甲基化在染色体水平上的外显子决定上起着重要的作用。表明DNA甲基化可以调控海岛棉纤维发育过程中的可变剪切。

       在玉米(Zea mays)研究中利用三代测序技术对玉米不同组织内的全长转录本进行了测序分析。作者在已有的玉米基因组B73 RefGen_v3注释之外发现了大量新基因和新的转录异构体，进一步对不同组织进行差异分析，鉴定到了许多组织特异性的转录本和可变剪接事件。结合已发表的甲基化测序数据，发现可变剪接位点的甲基化水平与可变剪接事件紧密相关。

【参考文献】Wang M, Wang P, Liang F, et al. A global surveyof alternative splicing in allopolyploid cotton landscape,complexity andregulation[J]. New Phytologist,2017, 217(1):163.

【参考文献】Bo Wang, Elizabeth Tseng, Michael Regulski, Tyson A. Clark, Ting Hon, et al.Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing.NATURE COMMUNICATIONS. 2016, IF= 11.329

【三代全长+二代测序】

       杨树（Populus trichocarpa）全长转录组研究采取了2+3联合分析的策略，对可变剪切在逆境响应中的重要作用进行了深入挖掘。可变剪切的分析结果显示，内含子保留是杨树中占主导地位的剪切形式，比例高达45%。对比不同条件下由可变剪切产生的isoform及其表达量，该研究发现差异性内含子保留（differential intron retention, DIR）是杨树应对干旱等逆境胁迫的重要分子机制。许多参与植物发育、细胞壁代谢、昼夜节律及应激反应的基因均受到DIR的调控。在不同的逆境胁迫下，这类内含子表现出协同性的保留上调或下调。Iso-seq可以直接获得这类isoform的完整序列，从而验证了RNA-seq结果。

【参考文献】Filichkin S A, Hamilton M, Dharmawardhana P D, et al. Abiotic Stresses Modulate Landscape of Poplar

Transcriptome via Alternative Splicing, Differential Intron Retention, and Isoform Ratio Switching[J]. Frontiers in Plant Science, 2018, 9.

【三代全长+二代测序+蛋白/代谢】

       从转录本到蛋白的角度去联合分析，可以用转录组的结果构建蛋白库，如果是做了多个样本的三代全长，则可以分析不同可变剪接形式所产生的蛋白丰度变化等等。

       而代谢是最接近表型的结果，转录组和代谢的联合分析思路当然也可以应用在这里。

       巨菌草研究案例中，以三代全长可变剪接为研究切入点，探讨低温胁迫下巨菌草的转录动态变化，揭示了低温诱导更多剪接异构体的产生，从而产生多样性的功能分子来适应环境的改变。在C18不饱和脂肪酸的合成和代谢中，通过对α-亚麻酸关联基因的定量研究，得出α-亚麻酸合成上调，而代谢被抑制从而响应低温胁迫的分子机制。

【参考文献】Zhu F, Chen M, Ye N, et al. Proteogenomic analysis reveals alternative splicing and translation as part of the abscisic acid response in Arabidopsis seedlings[J]. Plant Journal, 2017, 91(3):518-533.

【参考文献】 SMRT sequencing of a full-length transcriptome reveals transcript variants involved in C18 unsaturated fatty acid biosynthesis and metabolism pathways at chilling temperature in Pennisetum giganteum.BMC Genomics,2020.

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