【客户文章发表】利用曲霉和酵母对猪粪中铜的生物吸附特性及其微生物多样性研究

        8月12日扬州大学动物科学与技术学院在Frontiers in Microbiology（IF:5.640，Q1）期刊上发表了一篇题为《Biosorption of Copper in Swine Manure Using Aspergillusand Yeast: Characterization and Its Microbial Diversity Study》的文章，该文章就“添加不同菌株的真菌对猪粪中铜的生物吸附能力的影响”进行了研究。

        仔猪饲粮高铜添加量尽管可促进仔猪生长，提高饲料转化率，但90%的铜会被排出体外，积累并污染土壤。文章利用曲霉和酵母对猪粪中铜的生物吸附特性以及微生物多样性进行研究。

        原文链接：https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.687533

        发表期刊：Frontiers in Microbiology

        IF:5.640 Q1

        关键词:曲霉，猪粪，铜，微生物生物吸附，16S和ITS rRNA序列

引言

        微量矿物质可以提高仔猪的生长和饲料转化率，从而提高生产性能。饲粮中高铜可提高仔猪饲料消化率。

        长期使用高铜含量的粪肥和肥料增加了土壤污染的风险，可能进一步造成水和植物污染，甚至危害人类健康。

        真菌，如曲霉菌、枝孢菌和酵母，可以吸附和去除铜。研究表明，酿酒酵母、米曲霉、黑曲霉对水中铜的生物吸附效率较高，因此选择上述3个菌株进行猪粪吸收铜能力的测试。

材料和方法

真菌、猪粪和生物吸附条件的选择

        试验包括对照(CON)、酿酒酵母(SC)、米曲霉 (AO)和黑曲霉(AN)处理，每个处理重复3次。每个处理在猪粪中添加0.4%的真菌孢子(4 g/kg)，最终溶液铜含量为250 mg/kg。将粪便分成12个亚样，与上述溶液混合。孵育29 d，分别于第8 (D8)、第15 (D15)、第22 (D22)和第29 (D29)天进行生物吸附参数分析。

温度、pH值和霉菌毒素含量

        采集最终生物吸附状态(D29)的粪便样品，测定温度、pH值和霉菌毒素水平。采用黄曲霉毒素B1检测试剂盒、赭曲霉毒素A检测试剂盒、去氧雪腐镰刀菌醇检测试剂盒测定霉菌毒素浓度。

剩余铜浓度与铜的生物吸附速率

        对风干猪粪样品称重，测定残留铜浓度和铜的生物吸附率。用原子吸收光谱仪测定猪粪中铜离子的质量。沉积物在60◦C下干燥48小时，以确定铜浓度。

测序平台：Novaseq-PE250

统计分析

        采用spss13.0软件对温度、pH、霉菌毒素、铜残留浓度、铜生物吸附率和α多样性指数进行单因素方差分析。用GraphPad Prism 6.0软件绘制了铜的残留浓度和铜的生物吸附率折线图以及细菌和真菌类群分析。

结果

温度、pH值和霉菌毒素浓度

        对照组和黑曲霉处理的pH显著高于SC (P<0.05)。对照组黄曲霉毒素B1和脱氧雪腐镰刀菌醇浓度显著高于三个处理组(P<0.05)。温度和赭曲霉毒素A处理间差异不显著(P>0.05)。

剩余铜浓度与生物吸附速率

        与不同生物吸附期相比，除对照外，3个处理粪便中铜的生物吸附率和残留铜浓度均存在显著差异(P<0.05)。研究各组同一天铜的生物吸附率和铜残留浓度，AN、AO和SC处理显著高于CON (P<0.05)。总体上，除CON外，剩余铜浓度持续降低，生物吸附率从D0增加到D29。AN的铜残留浓度在D15、D22和D29上最低，生物吸附率最高，平均为84.85%。AO的生物吸附率达到81.12%，SC的平均吸附率为80%。

(A)不同处理不同天数猪粪中铜残留含量曲线图。(B)不同处理不同天数猪粪中铜的生物吸附率曲线图。

细菌和真菌测序OTUs和Alpha多样性

        维恩图显示，测序得到的细菌OTUs数量远高于真菌。此外，各处理检测到的OTU覆盖率均大于99.70%。从细菌alpha多样性来看，与对照相比，真菌处理没有改变OTU数量。对照和真菌处理间的Chao1、ACE、Shannon和Simpson指标无显著差异(P>0.05)。而真菌在α多样性方面，黑曲霉和米曲霉处理较对照和酵母处理降低了OTU数量、Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数(P<0.05)。

不同水平的细菌和真菌群落丰度

        细菌的种类在门和属水平上存在差异。门水平分类分析显示，细菌群落主要为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)。根据前10个属不同细菌之间的显著相关性建立热图相关分析。

        在门、纲、属水平上检测了4组真菌群落的相对丰度，4组间不同水平的分类存在差异。对前10个真菌属的热图相关性分析表明，曲霉属的丰度较高，与其他真菌属之间存在负互作，而其他真菌属之间主要存在共现相关性，这解释了为什么曲霉属的丰度较高。

AO和AN在微生物属水平上的轴向差异

        使用LEfSe分析CON、AO和AN组间细菌和真菌属分类的显著差异，并转化成可视化LEfSe结果。

功能预测

        FAPROTAX功能注释结果显示，细菌群落中含有大量与化学异养、需氧化学异养和发酵相关的序列。其他的生态功能，如纤维素分解、动物寄生虫或共生体、人类病原体和所有芳香族化合物降解也被预测在相对较低的丰度的细菌群落中存在。

        基于PICRUSt2的KEGG通路的细菌功能预测如图7所示。结果表明，鉴定的基因可能与代谢、遗传信息处理和环境信息处理等其他途径相关，包括细胞过程、生物系统和人类疾病，且相对丰度较低(图7B)。根据代谢途径，大多数预测基因参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、核苷酸代谢以及辅助因子和维生素的代谢(图7C)。此外，与本研究相关的另一个具有高丰度和环境信息处理的通路具有预测编码膜转运蛋白和信号转导蛋白的基因(图7C)。

讨论

真菌处理对生物毒素的影响

        在粪便中添加的曲霉对黄曲霉毒素B1有解毒作用，黑曲霉(AN)和鲁氏接合酵母可以降解80-90%的AFB1。赭曲霉毒素（OTA）在真菌处理和对照处理中浓度均低于4.0µg/kg，说明在生物吸附过程中不会产生OTA。脱氧雪腐镰刀菌醇是主要由镰刀菌代谢产生的霉菌毒素，对免疫系统有害。真菌处理的脱氧雪腐镰刀菌醇浓度低于0.25 mg/kg，显著低于对照组和酵母组。总体来看，发酵猪粪中真菌毒素浓度极低。

pH对生物吸附的影响

        微酸性pH更适合真菌吸收重金属。在酸性环境下，真菌的生物活性最高。在一定程度上，pH值越高，生物吸附率越高，当pH为3.0时，未见生物吸附。当pH值在4~6之间时，真菌的生物吸附能力最大，pH值在5~5.5之间有利于曲霉对污染物特别是重金属的吸附。而酿酒酵母在pH 2.5~4.5时表现出耐受性和适应性。本实验可能是由于pH值不适合酿酒酵母的生长。

真菌接种下的物种分布情况

        各组细菌群落的物种丰富度和多样性基本一致。真菌处理对细菌群落没有影响。酿酒酵母生长失败可能受一些抗生素、中药制剂和抗真菌剂以及其他真菌抑制的影响。

         细菌优势菌属主要属于拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门。它们是猪胃肠道和粪便中的优势门。拟杆菌门和厚壁菌门主要与碳水化合物代谢相关，而变形菌门主要与蛋白质代谢相关。细菌在吸附过程中的主导作用是分解粪便中的有机物，在这里代谢产生各种营养物质。

        综上所述，当真菌含量和铜浓度分别为为0.4%和250 mg/kg时，黑曲霉和米曲霉对铜的平均生物吸附率最高，达到85%。这两种菌株在还原铜方面都有显著的效果。虽然真菌处理降低了真菌丰度的多样性和丰富度，但对细菌丰度没有影响。文章提出可能有多种机制协同作用于铜的生物转化和吸附，以维持真菌细胞中铜离子相对稳定的状态。需要更多的研究来更好地了解真菌(如曲霉)对铜的生物吸附的具体途径。