基于线粒体基因组和核基因（18S，28S）研究Cryptocercu隔离分化和迁移扩散形成以及全球分布格局

本文是西南大学植物保护学院的车艳丽老师2021年10月22日发表在《Molecular Phylogenetics and Evolution》期刊上，IF:4.586。文章主要内容是利用动物线粒体基因组和核基因（18S，28S）研究Cryptocercu隔离分化、迁移扩散以及在全球的分布格局。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ympev.2021.107318

二、文章摘要

本研究测序45个隐尾蠊mtDNA来解决世界各地Cryptocercu之间的系统发育关系，在秦巴山区样品中发现了四种tRNA的重排类型。基于线粒体基因组和核基因（18S，28S）构建最大似然和贝叶斯系统发育树，揭示了隐尾蠊的6个主要谱系地理分布格局。用贝叶斯分子测年方法估算该属的进化时间，重建Cryptocercu祖先范围，推测出2次扩散事件和6次区域变异事件。最初的更替发生在80.5 Ma的美洲和亚洲血统之间，而后是美国43.8 Ma的更替事件；亚洲谱系2次扩散分别发生在31.9 Ma、21.7 Ma，4次更替事件分别发生在29.3 Ma、27.2 Ma、24.8 Ma和16.7 Ma。本研究表明分化和扩散对蟑螂的分布和多样性都起到了重要的作用。

三、背景和思路

亚群居蟑螂属 Cryptocercus and和真群居白蚁来自一个共同的祖先，他们存在于侏罗纪晚期至白垩纪早期。Laurasia解体之前，Cryptocercus 为无翅属，游走性低，在北半球（亚洲和北美）呈间断分布，一生生活在枯木中，以枯木为食。Cryptocercus属物种通常分布狭窄，仅限于有限区域。大陆隆升、冰川灭绝事件和火山造山作用可能影响 C. relictus 和 C. changbaiensis当前分布。认为寄主植物的区系变异和演替在 Cryptocercus 的大陆分布中起了重要作用。在形成当前世界昆虫地理格局方面，生态变异和扩散事件的相对重要性是一个活跃的研究课题。蟑螂，包括无翅和减翼种，也能通过漂浮在漂浮物和植被中的木筏传播。由于Cryptocercus属无翅、扩散能力低、形态保守性差、分布不连续，因此Cryptocercus属的成员成了理想的模型，可用于检验区域变异和扩散假说，并理解地理在物种形成和维持局部分化过程中的作用。最近基于部分线粒体序列或核基因标记的系统发育研究提高了对亚洲Cryptocercus与横断山脉物种形成事件之间关系的认识，然而，一些分类群之间的关系仍未解决。在本研究对45个线粒体基因组进行了测序，以补充代表五个Cryptocercus 物种现有数据，并获得了核基因（18S，28S）以解决这些分类群之间的系统发育关系。

三、材料和方法

2.1 取样、DNA提取及测序

图1 隐尾蟑螂的抽样地点

采集了45个样本，分别是30个Cryptocercu物种和1个隐尾蠊种群：34个来自中国的长白山、秦巴山和横断山区，11个标本来自美国加利福尼亚州、田纳西州、北卡罗来纳州、弗吉尼亚州和佐治亚州。标本储存在无水乙醇保存于−80℃冰箱。TIANamp Genomic DNA Kit (DP304, TIANGEN, Beijing, China)试剂盒提取肌肉组织总DNA并制备DNA文库。

测序和组装

PE 150 bp Illumina HiSeq2500平台测序；与已发表的隐尾蠊线粒体基因组进行比对；Geneious Prime 进行基因组注释；OGDRAW绘制基因组圈图；MITOS webservers注释tRNA基因；Geneious Prime鉴定rRNA（18S rRNA和28S rRNA）。

2.2 序列比对和数据集

构建84个线粒体基因组进化树分别是34个隐尾蠊（Cryptocercus）：2个蟑螂种类和32个蜚蠊科（个Blattidae，2 个Tryonicidae，2 个Lamproblattidae，10 个Blaberidae和15个白蚁）。66个物种的64个18S和63个28S序列。利用MAFFT v.7 （Q-INS-i算法）进行序列比对；MEGA 6.0.6进行PCG比对；GBlocks Web进行核糖体序列（12S，16S，18S和28S）比对。得到五个数据集（RNAPCG12）：（1）13个蛋白质编码基因的第一和第二密码子位置（PCG12）；（2） 12S rRNA基因；（3） 16S rRNA基因；（4） 18S rRNA基因；（5） 28S rRNA基因。另一个包括合并的tRNA基因 (RNAPCG12tRNA). 数据集。

2.3 系统发育分析

利用PartitionFinder 1.1.1软件筛选最佳核苷酸替代模型TIM模型 (TIM+I+G) 。采用最大似然法和贝叶斯构建系统发育树。RAxML 7.7.1构建ML树；Mr Bayes 3.2构建BI树。

2.4 分歧时间分析

BEAST 1.8.4软件对隐尾蠊物种和34个外群线粒体基因组和核基因数据进行分歧时间分析。根据化石的最早和最晚时间给出两个校准。

2.5 生物地理学分析

采用RASP 3.02软件S-DIVA统计学方法重建隐尾蠊地理范围的演化。确定了6个分布区：(A)横断山境内的川西高原；(B)横断山区内的云南高原；(C)秦巴山区；(D)包括俄罗斯东部和韩国在内的长白山；(E)美国西海岸；(F)美国东海岸。

四、结果和讨论

3.1 隐尾蠊线粒体基因组结构

图2 隐尾蠊线粒体基因组重排。

对31个隐尾蠊属的45个物种线粒体基因组进行测序，与GenBank中5个物种的7个MtDNA基因组相结合，发现38是完整MtDNA，大小在14945-17793 bp之间，A+T含量74.23%，C.habaensis最高（81.22%），C.neixiangensis的最低（72.68%）。与Drosophila yakuba序列比秦大巴山的8个样本中nad3和nad5之间的6个tRNA（trnA，trnR，trnN，trnS1，trnE，trnF）发生重排（图2和3）。

图3 TDRL事件解释隐尾蠊线粒体基因重排。

四种重排类型：（i）C.wuxiensis trnA的丢失（GO1）；（ii） C.ningshanensis的trnA、C.neixiangensis（BTM）（GO2）以及C.neixiangensis（MZL）（GO3）易位；（iii）C.hirtus（GO4）和C.shennongensis（GO5）中trnA的易位以及trnE/F的重复；（iv）C.neixiangensis（LYW）（GO6）和C.chengkouensis（GO7）的串联重复和随机丢失。此外，trnI-trnQ-trnM的重复仅在C.chengkouensis（GO7）中发生。

3.2 系统发育分析

图4 贝叶斯系统发育树

BI和ML系统发育分析显示白蚁和隐尾蠊科形成姐妹类群，与蜚蠊科和锥虫科关系密切(图4，S1-S3)。C. kagongensis与Cryptocercu之间的关系高度相似(图4和图S1)，北美隐尾蠊和亚洲隐尾蠊共同构成单系群。在北美分支中，Cryptocercus Clevelandi与CC.  punctulatus形成姐妹群。中国、俄罗斯和韩国的隐尾蠊分成四个主要谱系：一是俄罗斯、中国西北和南韩；二是秦大巴山；三是横断山脉四川西部高原；四是横断山脉云南高原。俄罗斯东部和韩国的分类群形成一个副系群。C. changbaiensis +C. kyebangensis的分支作为亚洲隐尾蠊的姐妹群位于基部。两种分析结果显示进化枝III和进化枝IV形成姐妹群，该进化枝加进化枝II与C.relictus形成姐妹群关系。但由于四川雷库沟隐尾蠊物种的存在，川西高原的Cryptocercu未能形成单系群。ML和BI两种系统发育树产生了几乎相同的拓扑结构，具有高节点支持（图S2和S3）。ML进化枝中C.changbaiensis+C.kyebangensis与 Asian Cryptocercus形成姐妹群关系（图1，S1-S3）。

3.3 分歧时间分析

图5 隐尾蠊系统发育和分化时间

隐尾蠊在下白垩纪至上侏罗纪期间从白蚁分化而来，分化时间140.5 Ma 。随后，隐尾蠊在80.5 Ma分化成北美隐尾蠊和亚洲隐尾蠊。北美分支中，C. clevelandi和 C. punctulatus的分歧发生在43.8 Ma。C. punctulatus的分歧在28.9 Ma，C. punctulatus复合体内，两个主要分支分歧发生在23.9 Ma。亚洲支系中，C.changbaiensis+C.kyebangensi首次与其他物种分歧发生在31.9 Ma ，29.3 Ma与秦大巴山和横断山的物种发生分歧。横断山脉和秦大巴山脉隐尾蠊的最新共同祖先出现在27.2 Ma。

图6 隐尾蠊祖先分布区重建

对隐尾蠊祖先分布区进行重建（图6）。推测，隐尾蠊祖先广泛分布在东亚和北美，发生两个迁移扩散和六个隔离分化事件（图6）。最初的变异事件（图6）发生在80.5 Ma的美国和亚洲血统之间，随后美国血统内的一种变异以及亚洲血统内的两个扩散及四个变异事件。同时在43.8 Ma美国西海岸的C.clevelandi与东海岸的C.punctulatus复合体之间发生变异事件（图6）；亚洲东北部的隐尾蠊祖先大约在25.8–39.5 Ma发生扩散（图6）。中国东北地区的C.relictus与其余的隐尾蠊物种，横断山与秦大巴山之间以及云南高原与四川高原西部之间的物种（图6）共发生了三次迁移扩散。最终，从云南高原谱系推断出一次扩散和一次区域变异事件（图6）。

4.讨论

4.1 Cryptocercu线粒体基因组重排

在秦大巴山的八种Cryptocercu物种中发现四种类型的基因重排（主要是tRNA-trnR-trnN-trnS1-trnE-trnF）（图2），重排基因通常位于ND3和ND5之间，可能由TDRL机制引起。研究表明，mt基因排列在密切相关的谱系中是可变的。三个近缘种C. luanchuanensis、C. neixiangensis、 C. sp1 显示了不同的tRNA基因重排类型和变化率。推断tRNA基因重排发生在秦大巴山脉物种中，横断山脉的物种中无，表明横断山脉比秦大巴山脉更为复杂，栖息地更为分散。

4.2 北美Cryptocercus系统发育及横断山脉分类群间关系

结果支持 Cryptocercus和白蚁的单系性，亚洲和北美Cryptocercu之间的姐妹群关系。BI和ML法恢复了 C. clevelandi and 和C. punctulatus复合体的单系性；确认了横断山脉Cryptocercu群的单系性，与Che等人（2020）的结果相反（该群与秦大巴山脉的分类群是副系的）。系统发育结果表明，长白山Cryptocercu分支是亚洲谱系中最早的，致使长白山地区（中国东北部、朝鲜和俄罗斯东部）的Cryptocercu与南方分类群有更多的同源性，该结果与先前研究的该类群单系恢复不一致。C. changbaiensis是C. kyebangesis的姐妹类群，与C. relictus不是姐妹类群。分析遗存的Cryptocercu与秦大巴山和横断山的其他Cryptocercu群关系更为密切。4.3 邻近和扩散事件对全球Cryptocercu分布的影响

分析确定了Cryptocercu分支起源： Cryptocercus c.起源于 140.5 Ma；北美和亚洲的分化时间是 80.5 Ma。表明现存的 Cryptocercus物种已经进化了 80.5 My。

重建地理学分布推断了两次扩散事件、五次区域变异事件。重建Cryptocercu的祖先范围：现存 Cryptocercus的祖先居住在北半球广阔的森林中，亚洲和北美的分离对 Cryptocercus的现代分布产生了重要影响。推测亚洲Cryptocercu的共同祖先生活在中国北部、俄罗斯远东和韩国在内的地区，从中国东北部、俄罗斯远东和韩国周边到南部地区的扩散事件（图6）发生在25.8–39.5 Ma， Cryptocercus的扩散似乎受寄主植物的演替控制，并且可能发生在长距离内。青藏高原30 Ma前后发生不超过2000 m隆升，在中国东北部的C.relictus与中部和西南部的其他物种之间区域变化事件（图6）发挥了重要作用。随后，随着青藏高原的持续上升，形成了更多的碎片化栖息地，可能导致横断山脉和秦大巴山脉谱系之间（图6）以及云南和川西高原之间（图6）发生两次邻近事件。C.  arcuatus、C.  habaensis 、Cryptocercus sp3的地理分布非常接近，它们的共同祖先（图6）很容易分散在川西高原的天然屏障上。之后在16.7 Ma相互独立出来（图6）。

最后五次扩散表明由于山脉抬升引起古代区域变化，包括北美的一次扩散事件和亚洲的四次发散事件。与Che等人（2020年）相比，本研究推断了两次扩散和两次以上的区域变异事件，它们之间的不一致可能是使用不同分类单元抽样和不同类型数据的结果。总的来说，提出的关于邻近发散的多个假设是初步的，但结果表明，邻近发散在Cryptocercu的全球分布中起着重要作用。

五、文章结轮

研究基于线粒体基因组和核基因数据，让我们对世界各地Cryptocercu物种间系统发育关系有更深的理解。研究支持单系分类群：1）北美，2）亚洲；3） 秦大巴山；横断山脉。因为川西高原热库沟有一种Cryptocercu，所以川西高原谱系和云南高原谱系是副系。本研究无法解决斑点Cryptocercu复合体内的关系，但额外的取样有助于我们更好地了解Cryptocercu在该区域的进化。本研究统计扩散区域变异为确定Cryptocercu的全球分布提供了强大支持。板块构造、植被演替和山脉抬升似乎通过邻近事件影响了Cryptocercu的分布，而扩散事件则塑造了Cryptocercu在亚洲东北部和横断山脉的分布格局。这些发现为更好地理解无翅昆虫进化提供了一个框架。