New Phytologist | 全基因组和全转录组关联研究揭示了高温胁迫下导致棉花雄性不育的遗传因素

  研究背景                            

      自20世纪初以来，全球变暖使全球平均温度上升了约1.5℃。由于棉花可生产天然纤维，其在全球广泛种植，有研究表明，高温胁迫会导致棉花雄性不育，从而导致产量大幅下降。目前，对棉花高温反应的遗传调控知之甚少，高温胁迫下棉花雄性不育的原因需要进一步阐明。因此，培育耐高温棉花种质，了解雄性生殖器官对高温的反应机制是十分必要的。

      2021年7月，国际权威学术期刊New Phytologist（IF:10.151）发表了题为“A combination of genome-wide and transcriptome-wide association studies reveals genetic elements leading to male sterility during high temperature stress in cotton”的研究论文（原文链接：https://doi.org/10.1111/nph.17325）。该研究利用全基因组和全转录组关联分析揭示了高温胁迫下棉花雄性不育的遗传因素，为进一步探究高温胁迫下棉花花药发育的分子机制提供了新的视角。

                       材料与方法                            

1、实验材料：本研究所用群体为在新疆阿勒尔以随机区组平地栽培的218份棉花材料。

2、RNA-Seq:对上述材料四分体时期的花药进行采样，提取RNA并进行转录组测序（Illumina），两次重复。

3、全基因组关联研究：使用TASSEL软件中的MLM进行GWAS分析。

                         研究结果                          

1、花粉活力与遗传多样性分析

     使用TTC染色对218份棉花材料进行了花粉活力的表型分析(图1a，b)。高温胁迫下，42份材料表现出很高的花粉活力(即> 90%的花粉是有活力的)，21份材料的活力很低(< 25%)；其他的表现出中等的花粉活力。

RNA-Seq对SNP进行了群体结构分析、系统发育树构建、主成分分析和LD计算（图1c-f）。发现218份材料可分为三个遗传群，分别有114份(红色)、39份(绿色)和65份(蓝色)样品。主成分分析表明，属于绿色组和蓝色组的材料被分别聚类，而红色组的材料在两个聚类中都被发现。这218份材料显示了自然的LD和种群结构，适合进一步分析。

图1.表型和基因组差异分析

2、转录组数据整合和共表达网络分析

      通过对棉花花药中lncRNAs的GC含量分析，发现与蛋白质编码基因(PCgenes)相比，lincRNAs和lncNATs都显示出较低的GC含量。lncRNAs和PCgenes基因转座元件（TE）重叠率比较显示，在转录体中，大部分的lncRNAs与TEs重叠，但位于PCgenes体内的TEs较少。而PCgenes和lncRNAs的表达水平在聚类分析中表现出相似的模式。108份材料显示271个基因的表达水平增加，而110份材料显示表达趋势降低，并构建了棉花PCgenes和lncRNAs共表达调控网络（图2）。

图2 棉花花药整合转录组分析

3、全基因组关联研究确定了与高温胁迫应激反应相关的三个位点

      为了鉴定参与花粉发育中高温胁迫反应的基因，获得了175 430个MAF>0.05的SNP，基于花粉活力值进行GWAS分析。使用这些SNP进行的关联分析发现了与花粉生活力相关的三个位点，三个相关信号的峰值SNP的单倍型显示出与高温胁迫下花粉生活力的表型明显相关（图3）。

图3 热胁迫下棉花花粉活性的关联研究

4、全转录组关联研究(TWAS)鉴定了一种在高温胁迫下赋予雄性不育性的基因Ghir_A01G006180

      本研究进行了转录组范围的eQTL鉴定。使用MAF>0.05的SNP进行关联研究，共鉴定出32 396个eQTLs，对8975个PCgenes和4157个lncRNAs有影响，覆盖棉花基因组中14%的基因，在局部eQTLs中，峰值SNPs大多位于受影响基因的10 kb以内，还研究了可能影响许多(>5个)远基因的单个eQTL，称为eQTL热点，共确定了179个eQTL热点，它们占据了整个基因组的205 kb。染色体A01、D01和D05在热胁迫下影响花粉生活力也被发现是eQTL热点。三个QTL中的候选基因Ghir_A01G006180、Ghir_D01G006520和Ghir_D01G006540也受到e QTLs的影响，表明棉花花药中基因表达与花粉生活力之间存在着紧密的联系（图4）。

图4 棉花基因组的表达数量性状基因座(eQTL)分析

5、GhHRK1是花药发育早期高温胁迫反应的负调节因子

      共发现13个显著的与花粉生活力相关的SNP位于Ghir_A01G006180中，Ghir_A01G006180编码一种蛋白酪氨酸激酶，其蛋白序列与拟南芥G型凝集素受体激酶基因At4g27290相似。将GH_A01G0682命名为热相关受体激酶GhHRK1。表达模式分析显示高温胁迫破坏了GhHRK1的表达谱，导致早期发育阶段(5-10mm芽)表达水平增加，但绒毡层降解阶段表达水平降低。在高温胁迫下表现出低花粉生活力的材料显示出相对高的GhHRK1 mRNA转录物积累。GhHRK1在四分体时期的低生活力材料的绒毡层和四分体中大量存在，这表明GhHRK1的表达与早期棉花花药中响应高温胁迫的花粉生活力丧失有关，并且可能是细胞生活力负调节途径的一部分（图5）。

图5 棉花花药中GhHRK1的功能特性

6、拟南芥同源GhHRK1突变体高温耐受性增强

      同源分析和系统发育树显示，At4g27290与GhHRK1同源性最高，在拟南芥突变体库中找到两个At4g27290突变体系SALK_067606C(hrk1-1)和SALK_129987C(hrk1-2)，这两个突变系幼苗期在高温条件下表现出营养发育增强，高温处理3 d后，突变花粉粒中也表现出较高的花粉生活力，有研究表明At4g27290与细胞极性相关，说明该基因可能在高温胁迫期间的花粉管伸长过程中发挥作用。在开花期对野生型WT和突变系hrk1-1和hrk1-2进行高温处理(31℃处理2 d)。与WT相比，在高温处理后的突变体中发现更高的结实率，而在正常温度条件下，WT和突变体之间的结实率没有明显差异，对WT和突变体进行了体内和半体内花粉管伸长分析，高温胁迫抑制了WT花粉管的伸长，而hrk1-1和hrk1-2的花粉管能正常伸长到雌蕊底部（图6）。转基因互补试验表明GhHRK1可能具有与At4g27290相似的功能，在植物的高温反应中起关键作用（图7）。

图6 拟南芥同源GhHRK1突变体表现出高温胁迫耐受性增强

图7 GhHRK1转基因拟南芥个体的表型分析

   小结                          

      为了揭示棉花花药在高温胁迫下的遗传调控机制，对218份棉花材料进行了花药转录组测序，进行了转录组数据整合和共表达网络分析，并构建了棉花花药的第一个转录组范围的变异图谱。通过对这218份天然棉花材料进行了花粉生活力的表型分析，发现高温胁迫对不同材料花粉活性的影响不同。转录组测序揭示了这些材料的遗传多样性。通过对转录组差异表达分析和全基因组关联研究(GWAS)，鉴定了三个耐热性相关基因座，包含75个蛋白质编码基因和27个长链非编码RNA（lncRNA），并为13132个转录本提供了表达数量性状基因座(eQTLs)。全转录组关联研究(TWAS)鉴定了6个与蛋白激酶活性相关的高温反应因素(3个基因与GWAS结果重叠)。并鉴定了一个在高温胁迫下的雄性不育基因Ghir_A01G006180。此外，本研究还鉴定到一个在棉花和拟南芥中先前未被表征的高温反应负调控因子GhHRK1。这些结果为棉花改良提供了潜在的目标，以满足高产、多抗育种的需要，并为高温胁迫下的生殖器官发育的遗传基础提供了新的认识。