植物细胞器编辑新方法——Golden Gate assembly system

文章介绍

本文是2021年5月11日发表在《Nature plants》IF：15.793 的文章。文章主要介绍的是开发了一个植物叶绿体基因组和线粒体基因组DNA编辑系统（Golden Gate assembly system），构建了DdCBE质粒。这种质粒能够使叶绿体中16S r RNA、PSA、PSB 基因的G.C to T.A，使线粒体基因组中的atp6、rps 14 基因中的G.C to T.A，并且这种突变在转染后的再生组织中持续保持。特别是用体外转录的cp-DdCBE mRNA可以避免质粒DNA片段在宿主基因组中的潜在整合。该技术可能会成为植物细胞器DNA编辑的宝贵资源。

研究内容

植物细胞器如叶绿体基因组和线粒体基因组都包含它们自己的基因组，分别编码许多呼吸和光合作用所必需的基因。植物细胞器中的基因编辑是对植物遗传学和生物技术的一种未得到满足的需求，但由于缺乏靶向这些细胞器中DNA适当工具而受到阻碍。在本研究中，我们开发了一个Golden Gate cloning系统，该系统由16个表达质粒构成（8个将产生的蛋白传递到线粒体，其他8个传递到叶绿体）和424个转录催化效应器阵列质粒组成，用来组装DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器 (DdCBE)并用所得到的DdCBEs有效地促进线粒体和叶绿体点突变。DdCBEs诱导莴苣或油菜愈伤组织碱基编辑频率高达25%（线粒体）和38%（叶绿体）。通过将DdCBE mRNA导入莴苣原生质体来显示叶绿体中 DNA-free 碱基编辑，以避免DdCBE编码质粒引起的脱靶突变。此外，通过在叶绿体16s rRNA基因中引入点突变，产生了对链霉素或大观霉素耐药的莴苣愈伤组织和植株，编辑频率高达99%。

可编程基因组编辑工具包括锌指核酸酶（zinc-finger nucleases），转录活性效应因子(TALE)核酸酶，规则间隔短回文重复(CRISPR)系统和由催化缺陷的 CRISPR相关蛋9(Cas9)变体和一个碱基脱氨酶蛋白组成的碱基编辑器，通过操纵基因组DNA序列用于植物遗传研究和作物改良。

然而，这些工具无法编辑植物细胞器（包括线粒体和叶绿体）中的DNA序列，可能是由于很难将导向RNA和Cas9蛋白同时输送到细胞器或同时在细胞器中表达这两种成分。植物细胞器基因组编码许多光合作用和呼吸所必需的基因。在细胞器中编辑这些基因的方法或工具是研究这些基因的功能和提高作物生产力和性状的首选方法。例如，线粒体atp6基因的靶向突变可导致雄性不育而叶绿体基因组中16S rRNA基因的特定点突变会导致抗生素耐药性。最近，Mok等人研究表明，无CRISPR DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器(DdCBEs)能够使哺乳动物细胞线粒体DNA中靶向C∙G-to-T∙A。由细菌胞苷脱氨酶毒素的无毒分裂域组成的DdCBE（(DddAtox)，定制设计的TALE阵列和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)作为异二聚体催化胞嘧啶脱氨，诱导c-t转化，在靶DNA中两个TALE蛋白结合位点的区域之间的间隔区内。本研究提出了一个快速方便的系统来组装DdCBE质粒在线粒体和叶绿体中表达，并利用得到的DdCBE在植物中展示高效的细胞器碱基编辑(补充图1)。

图1 植物细胞器基础编辑器Golden Gate assembly system。

为此，首先开发了Golden Gate assembly system来构建叶绿体靶向DdCBE(cp-DdCBE)质粒或线粒体靶向DdCBE(mt-DdCBE)质粒(图.1)。表达质粒编码由叶绿体转运肽（CTP）或线粒体靶向序列（MTS）、TALE N端或C端结构域、分裂的(DddAtox半体（G1333N、G1333C、G1397N和G1397C）和UGI组成的融合蛋白，这些融合蛋白是为在双子叶植物中表达而优化的密码子，在欧芹泛素（PcUbi）启动子和pea3A终止子的控制下定制设计的TALE DNA结合阵列的DdCBE质粒可通过在Eppendorf管中混合表达载体，六个TALE子阵列质粒在单个亚克隆步骤中构建。总共有424个（6×64个三方2×16个二分体2×4个单分体）模块化阵列质粒制造识别长度为16–20个碱基对的DNA序列的cp-DdCBE或mt-DdCBE，包括5′端的保守T。因此，功能性DdCBE异二聚体可识别32-40bp的DNA序列。

图2 植物叶绿体和线粒体碱基编辑

a-d cp-DdCBE在16srdna中诱导叶绿体碱基编辑的频率和模式

e-f mt-DdCBE在atp6基因中诱导线粒体碱基编辑效率和模式。将分离的DdCBE G1333和G1397转染到莴苣和油菜原生质体中。

为评估我们的DdCBE是否能促进叶绿体中的碱基编辑，我们构建了四对叶绿体16S rRNA基因（编码30S核糖体亚单位的RNA成分）的cp-DdCBE质粒，将每对质粒共转染到莴苣和油菜原生质体中，转染后第7天通过靶向深度测序测定碱基编辑效率 (Fig. 2a,b)。表现好的cp-DdCBE (Left-G1397-N + Right-G1397-C)诱发C∙G-to-T∙A 在15碱基对间隔区转换，在莴苣原生质体和油菜原生质体中两个序列结合位点之间突变频率分别为30%和15% (Fig. 2b)。与之前的哺乳动物细胞和小鼠结果一致，5′-TC基序中的胞嘧啶（C9和C13）通过cp-DdCBE优先转化为胸腺嘧啶。有趣的是，另一种cp-DdCBE (Left-G1333-N + Right-G1333-C)在莴苣原生质体应用中发现5′-AC环境中的胞嘧啶（C7）以4.2%频率转变为胸腺嘧啶。在培养14天的莴苣原生质体中cp-DdCBE介导的碱基编辑的持续性，编辑效率持续提高达10天，在整个栽培期间保持不变。

图3利用DdCBE编辑植物细胞器DNA

a植物细胞器突变示意图

b 无大观霉素条件下cp-DdCBE转染的愈伤组织C∙G-to-T∙A 转换效率

c DdCBE驱动的植物细胞器诱变综述

d 莴苣原生质体cp-DdCBE针对 16S rRNA编码的mRNA转染后诱导G C-to-TA转化频率

e 2.5 个月大的大观霉素抗性愈伤组织突变频率和编辑模式

f 抗链霉素植株中DdCBE mRNA 转染后C∙G-to-T∙A转化效率的Sanger测序色谱图

另外测试了叶绿体另外两个基因psbA和psbB的碱基编辑，分别编码光系统II的光合蛋白D1和CP-47(Fig. 2c,d and Supplementary Fig. 3) 。在四种针对psbA基因的cp-DdCBEs 中活跃的一个(Left-G1397-C + Right-G1397-N) 能够诱导C∙G-to-T∙A，莴苣原生质体转化率高达25%(Fig. 2d)。只有5′-TCC中的两种胞嘧啶（C11和C12）通过该碱基编辑器有效地转化为胸腺嘧啶，可能是5′-TCC先转化为5′-TTC，然后再转化为5′-TTT。在油菜原生质体中，其他分离对(Left-G1333-N + Right-G1333-C) 在四个胞嘧啶位置（C3、C4、C11和C12）活跃，编辑效率高达3.5%（C3）。注意在油菜基因中，C3和C4处于5′-TCC环境中，而在莴苣对应物中，它们处于5′-ACC环境中，由于单核苷酸多态性在油菜基因中DdCBE.负责两种胞嘧啶的高效编辑，但在莴苣中却无。同样地在油菜原生质体的 TCC 环境中cp-DdCBE针对psbB基因催化两种胞嘧啶的转化效率分别是 0.36% to 4.1%。综上所述，这些结果表明编辑效率取决于间隔区内胞嘧啶的位置和环境以及(DddAtox 分割位置(G1333 versus G1397)、方向(Left-G1333-N  versus  Left-G1333-C) ，并且展示了cp-DdCBE能够在植物叶绿体基因组中进行有效的碱基编辑。

接下来试图利用我们定制的mt-DdCBE在植物线粒体DNA中实现碱基编辑。为此构建了针对莴苣和油菜中atp6基因和油菜中rps14基因的mt-DdCBE编码质粒，将所得质粒转染到莴苣和油菜原生质体中，并在转染后第7天使用靶向深度测序测量碱基编辑频率(图.2e、f和补充图.4)。最活跃的mt-DdCBE能够催化C∙G-to-T∙A。atp6目标位点的转化率在莴苣中为23%，油菜中为23%(图.2f)。此外，在油菜原生质体中mt-DdCBE诱导C∙G-to-T∙A，rps14目标位点的转化率为11%。(补充图.4)。这些结果表明，植物线粒体DNA可以通过mt-DdCBEs进行碱基编辑。

为了研究DdCBE介导的cpDNA和mtDNA编辑是否在再生过程中继续保持。收集了从DdCBE处理的原生质体再生的莴苣和油菜愈伤组织，转染四周后(图.3a)，使用定向深度测序和Sanger测序测定每个愈伤组织中的碱基编辑效率(图.3b和补充图.5)。在愈伤组织中26个莴苣有22个、14个油菜中有7个检测到由叶绿体或线粒体基因特异的DdCBE诱导的碱基编辑，频率分别高达38%和25%（图.3c）。此外，在莴苣中叶绿体psbA基因的碱基编辑频率高达3.9%。(补充图.5)。同样，在油菜愈伤组织中检测到线粒体碱基编辑，atp6和rps14靶位点的突变频率分别高达25%、1.9%(补充图.5)。这些结果表明，DdCBE在植物原生质体中的表达是可以耐受的，再生过程中DdCBE诱导的细胞器基因编辑保持完整。

试图用体外转录的cp-DdCBE mRNA而非表达质粒证明细胞器中的 DNA-free基因编辑。针对16s rRNA基因的cp-DdCBE的体外转录物转染到莴苣原生质体中分析目标位点的基本编辑频率(Fig. 3a)。在原生质体中C-to-T突变，频率高达25%(Fig. 3d Supplementary Fig. 6)。正如预期，转染后第7天原生质体中缺少DdCBE mRNA或DNA序列(Supplementary Fig. 7)。这种方法可以避免质粒DNA片段在宿主基因组中的潜在整合。由于原生质体再生愈伤组织中细胞器的稳定维持，研究了 16S rRNA 基因中的叶绿体 DNA 编辑是否可以赋予对链霉素和大观霉素抗生素的抗性，他们不可逆地结合到16S rRNA，导致蛋白质合成的抑制。在链霉素耐药的原核生物和真核生物中，通常可以观察到16s rRNA基因的几种单核苷酸多态性；特别是16S rRNA C860T突变赋予烟草对链霉素的抗性。烟草中受C860T点突变影响的核苷酸，莴苣中等效核苷酸对应C9位置(Figs. 2a.b、3b.d)。将DdCBE处理的莴苣原生质体再生的愈伤组织转移到含有链霉素或大观霉素的培养基中，模拟处理的愈伤组织暴露于抗生素后变白，表明原生质体功能障碍(Supplementary Fig. 8)。相反，经DdCBE处理的愈伤组织仍呈绿色，显示出对这些抗生素的耐药性。研究分析了DdCBE在产生的抗生素莴苣愈伤组织和植株中的编辑效率。C9位置的C-to-T转换，在愈伤组织、耐药愈伤组织再生的芽中与C860T突变相对应，观察到的突变频率高达98.6%(Fig. 3e.f)。无大观霉素条件下，C13位置附近检测到的C-to-T编辑频率高达20%，但在抗生素情况下，这一点都没有，表明药物治疗时对这种突变的选择是正确的。综合来说，DdCBEs在原生质体中诱导的植物细胞器突变可以在细胞分裂后维持；通过药物选择可以实现植物的发育和叶绿体的近同质化。

图4 比较转染DdCBE质粒或转染DdCBE mRNA的莴苣原生质体靶点附近的脱靶活性

分析了原生质体、愈伤组织和芽中针对16S rRNA位点的TALE脱氨酶的脱靶活性。根据序列同源性选择目标位点附近（±50碱基对）（补充图9）或叶绿体基因组前五个候选非目标位点在抗生素抗性愈伤组织或芽中的单个细胞未检测到脱靶突变(Supplementary Fig. 10)。相反，当编码DdCBE对的质粒用于转染原生质体，脱靶的 TC-to-TT 突变在目标部位附近诱导，在五个候选非目标站点中的三个站点是低频率范围（1.2%-4.1%）(Supplementary Fig. 10)。使用mRNA代替编码TALE脱氨酶的质粒在很大程度上避免了原生质体中的这些脱靶活性 (Fig. 4)。这些结果表明DdCBE的过度表达或长时间基于质粒的表达可引起非靶点突变和瞬时突变，使用mRNA进行基于mRNA的表达是为了避免偏离目标的碱基编辑。

研究结论

总之，本研究开发了 Golden Gate cloning system，共使用424个TALE子阵列质粒和16个表达质粒组装植物细胞器碱基编辑的DdCBE编码质粒。定制的DdCBE针对叶绿体DNA中的三个基因和线粒体DNA中的两个基因，在莴苣和油菜原生质体中实现了高频率的C-to-T转化。重要的是在细胞分裂和植物发育过程中，植物细胞器中的编辑保持不变。此外，通过诱导叶绿体16s rRNA基因突变，我们能够获得抗抗生素的莴苣愈伤组织和具有近同源性（99%）的植株。即使没有抗生素选择，编辑频率在线粒体高达25%，叶绿体高达38%。需要进一步研究DdCBE诱导的异质性是否会引起表型效应，细胞器编辑效率是否可以通过工程DdCBE来提高。我们期望Golden Gate cloning system将成为植物细胞器DNA编辑的宝贵资源。

研究方法

植物原生质体表达质粒的构建

DdCBE Golden Gate 使用Gibson组装构建目的载体，编码TAL N末端结构域的序列 HA tag, FLAG tag，TAL C端域分离被优化的DddAtox和 UGI 密码子用于在双子叶植物（拟南芥）中表达，并通过集成DNA技术合成。来自 AtinfA15 和AtRbcS的CT，来自 ATPase delta subunit17和 ATPase gamma subuni的编码序列用拟南芥 cDNAs.扩增。PcUbi启动子和pea3A终止子用来替换质粒中CMV启动子进行植物表达。构建体外 DdCBE mRNA转录载体，在PcUbi 启动子 和 DdCBE编码区间将T7启动子克隆到 DdCBE Golden Gat目的载体中。

TALE 阵列基因用one-way Golden Gate assembly 克隆；使用424个TALE阵列质粒和目的载体，通过BsaI消化，Golden Gate assembly产物的T4 DNA连接构建DdCBE。One-way Golden Gate 克隆用以下方法：20 cycles of 37 °C， 50 °C for 5 min each，followed by final incubations at 50 °C for 15 min ， 80 °C for 5 min。所有植物原生质体转染载体均用Plasmid Plus Midiprep kits(Qiagen) 纯化。载体构建的DNA和氨基酸序列见补充序列1-3。

mRNA体外转录

用Phusion高保真DNA聚合酶(Thermo Scientific)通过PCR制备DdCBE DNA模板，使用体外mRNA合成试剂盒(Enzynomics)合成并纯化DdCBE mRNA，DNA模板PCR扩增引物见补充表1。

原生质体分离和转染

莴苣种子在70%乙醇中表面灭菌30s，0.4%次氯酸盐溶液15分钟，蒸馏水清洗三次，然后再0.5×Murashige和添加2%蔗糖MS培养基上培养，条件为光照16小时，暗培养8小时，温度25℃。油菜种子用70%乙醇中表面灭菌3分钟，1.0%次氯酸盐溶液30分钟，蒸馏水冲洗三次。油菜种子在添加3%蔗糖的1×MS培养基上培养，条件为23℃光照16h，暗培养8h，最后培养发芽。

原生质体分离和转染如前所述7日龄莴苣和14日龄油菜植株的子叶在室温下黑暗中摇动（40 r.p.m.）培养3 h，用酶溶液（1% viscozyme, 0.5% celluclast, 0.5% novozyme, 3 mM MES, 9% mannitol and CPW salts, pH 5.8）消化。原生质体-酶混合物用等体积的W5溶液（154 mM NaCl、125 mM CaCl2、5 mM KCl、5 mM葡萄糖和1.5 mM MES，pH值5.6）洗涤，并在蔗糖梯度（21%）上80 g离心7 min获得完整的原生质体。聚乙二醇（PEG）介导转染之前，原生质体在W5溶液中4℃培养1h。

用PEG（40%（w/v）PEG 4000、0.2 M甘露醇和0.1 M CaCl2）转染质粒（30μg/个）或mRNAs（40μg/个），将莴苣原生质体（5×105）和菜籽原生质体（2×105）重新悬浮在MMG溶液（0.4 M甘露醇、15 mMgCl2和4 mM MES，pH 5.7）中介导转染在室温下培养20分钟。将PEG-原生质体混合物用等体积的W5溶液温和倒置洗涤三次，然后孵育10分钟，最后100 g离心5分钟。

原生质体培养

将转染DdCBE编码质粒的莴苣原生质体重新悬浮在莴苣原生质体培养基（LPCM）（0.5× B5 culture medium supplemented with 375 mg l⁻¹ CaCl2 ∙ 2H2O,

18.35 mg l⁻¹ NaFe-EDTA, 270 mg l⁻¹ sodium succinate, 103 g l−1 sucrose, 0.2 mg l⁻¹ 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 0.3 mg l⁻¹ 6-benzylaminopurine (BAP) ,

0.1 g l⁻¹ MES）。LPCM中的原生质体以1:1的比例与含有2.4%低熔点琼脂糖（琼脂糖VII型），并立即放在六孔板上。混合物凝固后，将嵌入的原生质体覆盖在1 ml LPCM上，25°C下暗培养一周。初培养后，每周用新鲜LPCM替换覆盖的LPCM，并将嵌入的原生质体25°C、16小时 dim light和8小时暗培养一周，然后在16小时光照和8小时黑暗培养两周。原生质体诱导的愈伤组织在再生培养基（(1× MS regeneration medium supplemented with 30 g l⁻¹ sucrose, 0.1 mg l⁻¹ α-naphthaleneacetic acid (NAA), 0.5 mg l⁻¹ BAP ， 0.7% plant agar）持续四周，条件是25°C，光照16h，暗培养8h。为了分析碱基编辑效率，将转染的原生质体在25°C的LPCM中暗培养一周而不包埋。为了检测抗生素耐药性，将一个月大的嵌入式愈伤组织转移到含有50 mg l⁻¹的streptomycin 或 spectinomycin 再生培养基上持续四周，条件是25°C，光照16h，黑暗8h。四周后，抗生素的绿色愈伤组织或不定芽转移到含有200mg l的新鲜再生培养基中（50 mg l⁻¹的streptomycin 或 spectinomycin ）。

将转染DdCBE编码质粒的油菜原生质体重新悬浮在油菜原生质体培养基中（1× B5 culture medium supplemented with 0.6 g l⁻¹ CaCl2、 20 g l⁻¹ glucose、70 g l⁻¹ mannitol、1 mg l⁻¹ NAA、1 mg l⁻¹ BAP 、 0.25 mg l⁻¹ 2.4-D）。将原生质体RPCM混合物转移到六孔板中，25°C暗培养两周。两周后，原生质体在25°C、16小时dim light、8小时黑暗培养三周。每周用新的RPCM更换RPCM。

DNA和RNA提取

使用DNeasy Plant Mini Kit或RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）从液体培养基中培养的细胞和转基因愈伤组织中提取总DNA或RNA。培养的细胞和愈伤组织在100000 r.p.m. 离心后获得。反转录使用 RNA to cDNA EcoDry Premix (Oligo dT) (Takara)。

靶向深度测序

用Phusion高保真DNA聚合酶和合适的引物扩增靶区。进行三轮PCR（第一轮，巢式PCR；第二轮，PCR；第三轮，索引PCR）以制作DNA测序文库，MiniSeq（Illumina）建库测序。配对末端测序文件由Cas分析仪分析(http://www. （www.rgenome.net），电脑项目的源代码在t https://github.com/ibs-cge/maund.网站。