真菌线粒体研究思路以及研究用到的软件分享

真菌线粒体研究思路以及研究用到的软件分享

文章简介

       本文是Yildiz Gozde , Ozkilinc Hilal来自Çanakkale Onsekiz Mart University, Çanakkale, Turkey发表的，研究内容是测序褐腐真菌病原体基因组特征研究基因组的内含子进化、重复序列、致病性等。文章发表时间2021年5月12日，杂志《Frontiers in Microbiology》，影响因子5.640（Q1）。

       原文链接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.647989/full

摘要

       Monilinia fructicola和Monilinia laxa物种是最具破坏性和经济破坏性的真菌植物病原体，在全世界的石头和柚子果实上引起褐腐病。线粒体基因组（mitogenomes）在影响真菌病原体进化机制和方向方面发挥着关键作用。在所有样品中大部分是保守的，除了一个分离株的中rps3的顺序。但是，线粒体基因之间的A/T和G/C偏斜有所不同。在物种之间的几乎所有蛋白质编码基因（PCG）中都检测到了纯化选择。从该研究获得的14个核心线粒体PCG和rps3的氨基酸序列的组合数据集与来自Heliotales的一些其他物种的公开的线粒体基因组序列一起用于推断最大似然（ML）系统发育树。ML树表明，两种Monilinia物种以及来自同一顺序的一些其他真菌物种彼此高度分歧。线粒体基因组含有大量关于真菌植物病原体进化的信息，这可能有助于预测致病生命策略。

材料和方法

   原材料

       选择Monilinia物种的分离物。原始分离物长期储存在−Whatman 1号滤纸上20°C。从土耳其六个城市的不同果园的感染桃果实中获得分离物。从大量的Monilinia样品中选择了16个分离物。选择的分离物在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上于23℃在黑暗中从其原始储存的培养物中生长。将菌丝体转移到马铃薯葡萄糖肉汤中，并在室温下在旋转振荡器上以150rpm温育5-7天以进行基因组DNA分离。

   测序

        使用用于真菌/酵母基因组DNA分离的商业试剂盒进行总DNA提取。用分光光度计和荧光计评估DNA的浓度和纯度，然后将DNA进行基于Illumina的文库构建和短读测序。

   组装

       NGS提供的具有350bp插入大小的配对末端2×151bp。通过使用Trimmomatic 0.36除杂。FastQC质量检查。从头组装线粒体基因组，并使用GetOrganelle v1从完整的基因组数据中提取。K-mer值：105，包括SPAdes 装配程序。使用Geneious 9.1.8程序可视化。

   注释

       MFannot和Mitos注释PCG，RNAweasel注释trna

   序列分析

       AT skew、GC skew；PCG 的Ka、Ks。使用Mauve v2分析基因组。统计各个序列的内含子特征。

结果与讨论

       M. fructicola的线粒体基因组大小范围为158607至167838 bp，M.laxa的线粒体基因组大小范围为178351至179780 bp。

       16个线粒体基因组的核苷酸含量根据其AT和GC偏斜值表示。除了atp6，cox1，cox2和cox3的基因表现出正的AT偏斜外，许多PCG对这两个物种都表现出负的AT偏斜。

       Mauve比对反映了16个线粒体基因组中的同源性，其被分成11个同源区域并用不同颜色的同线性块表示。果糖乳杆菌分离株3的线粒体基因组中的基因顺序是保守的，除了rps3基因的顺序，其在编码T-B1-A5的分离株中不同。在分析的线粒体基因组中发现Rps3作为独立基因。M.laxa分离株的线粒体基因组中的基因顺序在该物种内是保守的。

       在M.fructicola中，每个基因的内含子数为Cox1含13个内含子，cox2含5个内含子，cox3含7个内含子，cytb含7个内含子，nad2和nad4含1个内含子，nad5含2个内含子，atp6含2个内含子，以及具有四个内含子的大小核糖体亚基。另一方面，发现nad1，nad3，nad4l，atp8和atp9是无内含子基因。果糖乳杆菌分离株的泛线粒体基因组的内含子覆盖了整个基因组的42.2%，

       并且在非编码区（28%）和编码区（14.2%）内。M.laxa分离株的有丝分裂基因组中的内含子覆盖了整个泛线粒体基因组的38.9%，并且在非编码区（16.3%）和编码序列内（22.6%）。

       对于M.fructicola分离株，携带内含子序列最多的基因是含有72.8%的cytb，

       富含内含子的基因其次是cox1（66.5%），cox2（61.5%）和cox3（53%）。

       在cox2基因中发现内含子含量最高，为65.4%，其次是M.laxa分离株的nad1（65.2%），cytb（62.1%）和cox3（53%）。

       由于所有氨基酸序列在物种内都是保守的，因此对于每个Monilinia物种，分离物聚集在一起。然而，M.fructicola和M.laxa以高自举值彼此分离。两种Monilinia物种也与Heliotales的其他物种明显相关。

讨论

       决定线粒体基因组大小差异的主要因素是内含子，移动内含子组和重复序列。此外，在M.fructicola分离株内的rnl基因内检测到未知序列及其重复序列，并且在M.laxa分离株的线粒体基因组中未发现。该未知序列的起源和重复可能是由于移动内含子组的移动性。

       已知真菌线粒体基因组具有高AT含量。据报道，基因组的高GC含量影响基因组，从而在高温，紫外线照射和杀真菌剂中发挥维持DNA稳定性的优势。本研究两个物种AT含量较高，可能解释了长度变化这一现象。重复元件的扩展可能导致复制滑动，并且线粒体复制过程的校正以及校对效率在物种之间可能有所不同。已知重复富集区域比其他基因组区域进化得更快。观察到这些分离株的基因组大小和毒力程度之间呈负相关。移动内含子是在两种Monilinia物种中高度发现的线粒体基因组大小差异的另一个主要来源。这也佐证了内含子含量越丰富，作为病原体的毒力越低。

文章亮点：

该篇论文在于探究真菌的病理学特征，别出心裁的从线粒体基因组角度出发。常见的研究真菌的毒力一般会从核基因组，蛋白代谢等方面去研究。该实验分为两个对比组，从短重复与修复机制出发，通过高重复区的长度内含子的个数以及长度部分的验证了线粒体基因组与毒力的负相关。