【经典文章】测序细胞器基因组转录组分析其RNA发一区10分文章

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U-to-C RNA编辑的植物模型：角苔细胞器基因组、转录组、编辑组和候选RNA编辑因子。

       本文是德国波恩大学、苏黎世大学等学校2019年11月20日发表在《New Phytologis》（IF：10.159）题为“Towards a plant model for enigmatic U-to-C RNA editing: the organelle genomes, transcriptomes, editomes and candidate RNA editing factors in the hornwortAnthoceros agrestis”。研究内容是通过新模式植物角苔，测序其叶绿体线粒体基因组及其转录组分析其细胞器基因组中的C-U的进化机制，利用核基因组PPR蛋白研究寻找RNA编辑的候选因子。

         原文链接：doi: 10.1111/nph.16297

研究背景

       陆地植物中角苔的系统发育位置仍有争议，人们已经认为角苔是维管植物的姊妹，因为在苔藓植物的另外两个分支：苔类和苔藓中缺少一个共享的线粒体内含子。角苔气管植物得到了系统基因组序列数据集的良好支持。最近的核转录组数据集系统发育分析提出了早期胚胎植物系统发育的替代方案。植物线粒体叶绿体中U-to-C RNA的“反向”编辑有意义，将进一步提供HT分支的分子突触形态。尽管C-to-U RNA编辑存在所有陆地植物分支中，但在苔类和苔藓中未发现U-to-C编辑的证据，但U-C的RNA 编辑在角苔、蕨类植物、石松、水韭目中大量存在。C-to-U RNA编辑的机制已经非常清楚，目前对开花植物拟南芥，水稻，苔藓植物小立碗藓80个位点特异性RNA编辑因子进行表征，这些位点独特的RNA结合五肽重复序列（PPR）蛋白质，具有额外的羧基末端结构域E1、E2和DYW。它们在编辑因子的上游 PPR 阵列属于“PLS 型”，具有经典的 35 个氨基酸 P 型重复序列以及较短（S 型）和较长（L 型）变体。PPR阵列是以每个核糖核苷酸一个PPR的方式特异性结合转录本的基础，已经确定了PPR-RNA识别代码的要点，其中第五（5）个和最后（1）个氨基酸是识别RNA靶中单个核苷酸的P型和S型PPR。

       鉴于与已知的胞苷脱氨酶明显相似，末端DYW结构域携带酶活性将胞苷转化为尿苷的主要候选结构域。小立碗藓RNA识别的上游PPR延伸到下游E1、E2和DYW结构域，对于所有编辑因子都是明显的。由于这种植物模型简单，苔藓中的所有细胞器编辑位点都被分配到了相应的DYW类型编辑因子。开花植物中细胞器RNA编辑的设置更为复杂，其中缩短的蛋白质与反式在更复杂的编辑体中由额外的辅助蛋白介导，与C-to-U编辑相比，不知道反向U-to-C RNA编辑的机制。为了这个目的认为角苔是最适的候选者，假设独立于苔藓植物之间的确切系统发育位置，在系统上最接近U-C RNA编辑的进化起源。因此组装了角的叶绿体线粒体基因组分析转录组和编辑组以及角苔中“DYW型”PPR蛋白。研究推测，U-to-C RNA编辑起源于更古老和更广泛的C-to-U编辑，用与生化酶变体相关的RNA目标识别相同的机制，可能将脱氨酶转化为转氨酶。由于陆地植物中C-to-U RNA 编辑可能较早的进化起源，表明 PPR 蛋白仍然存在于目标识别的核心同时也适用于 U-to-C 编辑。研究提出了潜在 U-to-C 的第一个候选，未来的功能研究中将A. agrestis RNA 编辑因子研究  作为植物分子生物学中新兴的新模型系统。

材料和方法

DNA/RNA 提取和测序

       提取角苔（100 ng），Illumina二代测序获得数据量2G， A5-MISEQ组装。4周龄配子体组织提取总RNA，Illumina HiSeq4000建RNA 库，获得数据量1G。

细胞器组装

       选用K-mer值141bp利用MEGAHITsoftwar组装获得完整的线粒体基因组。

RNA编辑事件确定

       TRIMMOMATICv.0.35 对DNA reads和新生成的RNAreads修剪。JACUSA确定生成的两个映射文件之间的RNA–DNA差异。RNA编辑位点识别覆盖率阈值为至少30 reads，编辑效率至少为5%。

候选RNA编辑因子的鉴定

       PPR类型的重新评估，E1、E2和DYW结构域为识别编码结构域的蛋白质，PPR finder工具在基因组中查找，鉴定3089个 PPR蛋白，其中1464个“E+”显示其氨基末端具有特征性PG盒或其变体的DYW结构域开头。PPR重复序列中提取位置5和L（last）处的氨基酸。

系统发育树构建

       PPR蛋白对齐后（三个C端PPR P2、L2和S2、E1和E2域，选择延伸至DYW结构域前20个氨基酸）进行系统发育分析。由于36种蛋白质（包括三种“纯”DYW蛋白质）在C端结构域中表现出变性，最终鉴定出1428种用于系统发育重建。

PPR目标预测

       提取P型和S型的PPR位置5和L，将其转换为权重矩阵作为输入，根据PPR RNA识别代码进行匹配的任意数字分配。对新确定的细胞器编辑组，使用TARGETSCAN选项“在已编辑点周围”搜索目标。ISC值除以相应的矩阵长度（ml），以补偿PPR阵列的长度差异。

结果

角苔质体

       角苔质体为环状，典型四分体结构，LSC长107 329 b，SSC长22 167 bp，IR长15 632 bp。角苔cpDNA具有预期的基因补体，特别是芽孢角苔的连续的大的开放阅读框ycf1被破坏。Leiosporoceros dussii 中也有一个大的连续的ycf1，角苔属中大叶绿体rRNA的RRN23基因中，只有一个内含子I型（rrn23i2620g1）。IR编辑扩展到rps12、rps7、ndhB 3’末端，在其他陆生植物中是LSC的一部分。与角苔其他物种比A. agrestis缺少SSC中ycf1和ndhH之间的rps15基因。Leiosporoceros中检测到了psbK和psbI之间的atrnS-CGA基因。仔细观察藓类中花叶溪苔、苔藓类藻苔以及角苔中其他物种中这种特殊的基因也是保守的。

角苔叶绿体编辑组

       使用12个非被子植物叶绿体参考文献预测了1371个RNA编辑候选位点（PREPACT），对转录组数据分析，确定了角苔中1549个叶绿体RNA编辑位点（636个C-to-U和913个U-to-C编辑），叶绿体编辑组5’和3‘非翻译区（UTR）中共67个编辑位点，内含子中有27个以及无法预测的编码区的124个沉默编辑。在AGY丝氨酸、CGY精氨酸、GGY甘氨酸或UGY半胱氨酸密码子中未观察到嘧啶交换的任何沉默编辑，完全符合之前仅在胍下游进行罕见的RNA编辑。许多沉默位点和编码区外的位点被编辑的程度远远低于处于密码子改变位置的位点。

       确认非沉默RNA编辑位点与预测非常吻合，共有275个框内终止密码子通过U-to-C编辑（表S1）从阅读框中删除，6个起始密码子（inatpB、atpH、ccsA、cysA、ndhD和petA）和4个终止密码子（inndhC、ndhG、petD、a n dpetG）通过C-to-U编辑创建（表1）。只有五个非常短的阅读框和psbA不受RNA编辑影响。atpA 转录本有 35 个非沉默编辑位点效率是 75% - 98%，唯一沉默位点 (atpAeU1068PP) 编辑效率仅为 10%。在 psbC 中，15 个预期的非沉默位点编辑效率为 91-99%，而一个非沉默“额外”编辑不重构保守氨基酸 (psbCeC734IT) 和 5’-UTR 中的另外两个编辑效率 为5-11%。psaB 有两个沉默位点（psaB eU15FF 、psaB eU525LL) 以 97% 以上的高频编辑。验证了 chlL 中许多预测的 RNA 编辑位点，A. agrestis 中的 ccsA、ndhE、petN、psaJ、psbN、rpl14 和 rpl22在姐妹物种 A. angustus 中似乎也是必要的，只有21个强烈预测的编辑事件未得到证实。

       在角苔属姐妹物种发现不同的RNA编辑模式，一个物种中编辑的核苷酸可以与相应其他物种的cpDNA中已经存在的适当嘧啶进行“预编辑”。大多数C-to-U编辑在这两个分类群之间共享，而A. angustus基因组水平的胞苷U-to-C编辑位点的变化要大得多，psbC和psbD 就是典型的例子。角苔属有44个非沉默编辑，psbC 17个，psbD 27个，12个是两个共有的，32个出现在一个分类群中。在转录水平上重组另一个分类群中的基因组，.A. agrestis两个基因中有26个独特的编辑位点是U-to-C编辑。

       RNA编辑有助于将细胞器基因分类为功能基因或假基因，尤其是U-to-C编辑将阻止大量必要的转换为谷氨酰胺或精氨酸密码子。matK是突变体基因内含子II中的成熟酶，在植物中高度保守，预测了11次编辑，但频率非常低。A. agrestis中matK 为假基因，为A. angustus 同类更早的退化状态。trnK的宿主基因内含子像预期的那样进行有效编辑。A. angustus的trnK在DNA水平上具有UUC反密码子，该反密码子会错配GAR谷氨酸密码子，会被编辑成UUC反密码子来正确匹配AAR赖氨酸（K）密码子。 RNA 编辑模式表明 matK 是假基因，对于 rps16 下游的角苔特异性小 ，orf51 观察完全相反，缺乏与其他蛋白质序列相似性。研究发现三个 RNA 编辑位点与 A. angustus 共享，支持可能的功能角色。

角苔的线粒体区

       角苔的线粒体基因组长 227 925 bp ，比N. aenigmaticus、Phaeoceros laevis 大，比A. angustus的线粒体基因组小。角苔属线粒体区扩展是由一组更大的内含子、更大的内含子序列、更少的假基因退化和更大的基因间序列导致。

线粒体基因补体

       角苔. mtDNA 反映了进化上的古老状态其完整基因（atp8、RPL2和TRNS GCU）在其他角苔纲中退化或缺失。A. agrestis线粒体区其他内含子中携带两种可能是功能性成熟酶：mat-cox2i373g2、mat-cobi787g2c。研究建议在后一种情况下添加“c”，以表明成熟酶ORF与宿主基因上游阅读框是连续的。像cob宿主基因，mat-cobi787g2c大量编辑，包括几个明显重建成熟酶中保守氨基酸位置的位点。

线粒体内含子

       A. agrestis 线粒体基因组创下了胚胎植物细胞器基因组的记录，共有44个内含子，其中一些在其他角苔纲其他物种中缺失，其中内含子I 有4个，ii组有40个，退化的假基因cCMFC、RPS3和SDH3中可检测的“化石”内含子。所有这些都在A. angustus线粒体DNA中也存在。内含子atp9i87g2在苔类、苔藓和石松中保守，但在Nothoceros、Phaeoceros.不存在。A. angustus中很可能是因为第二个ATP9外显子只有8个碱基，所以注释中遗漏了它，并且错误地与 atp9i95g2 合并。角苔属包含 cox1i249g1, cox1i653g2, and cox1i1116g1.三个内含子，其中cox1i249g1和cox1i653g2与数据库中序列都没有显著相似性。检测内含子I型的cox1i1305g1，在之前的角苔纲线粒体DNA研究中被忽视，错误地注释为一个更大的上游cox1i1298g2，这同样是由于一个只有7 bp的微小外显子。Anthoceros punctatus中的nad5i881g2内含子在角苔属和Leiosporoceros中保守存在，但在角苔纲其他物种中不存在（表2）。

       A. agrestis 的假基因rps3i74g2内含子只在维管植物中检测到。现在发现rps3( rps3i74g2)、rpl16在A. angustus, 中也作为假基因存在。rps3i74g2的发现增加了HT分支的候选突触形态。本研究鉴定了trnS-GCUi43g2内含子在内的trnS GCU基因，该基因在苔类植物中保守，在之前的角苔纲线粒体DNA注释中被忽略。

       A. agrestis 的线粒体RNA 编辑组

       角苔线粒体核转录组鉴定了496个C-to-U， 403 个U-to-C的编辑位点。因此，叶绿体在总数量（1549对899）和U-to-C/C-to-U比率（58%对46%）上都超过了线粒体RNA编辑。在IGSs罕见的编辑中，pL2和p9之间大型假基因丰富的IGS中发现四个编辑位点，可能是以前功能性的rps3和rpl16编辑的遗留物，在atp8和nad5之间富含假基因的IGS中发现了10个编辑，但不影响rpl10假基因。

线粒体基因组RNA 编辑在5’和 3’-UTR及其他结构中RNA含量较低，值得注意的是trnD-GUC编码的tRNA Asp（GUC）。两个U-to-C编辑事件通过转换G–U到 G–C碱基对加强二氢尿苷和假尿苷干中的碱基配对。在线粒体内含子中检测到许多编辑，内含子II型末端特征结构域V和VI中，嘧啶交换的两个方向上有61个RNA编辑位点。

       A. agrestis中的大多数编辑活动有助于稳定这两个小结构域在3’内含子末端的特征结构，并在其他角苔纲的同源内含子线粒体DNA水平上以“预编辑”状态存在。尽管叶绿体在线粒体RNA编辑中占主导地位，但叶绿体内含子受到的影响要小得多。在V结构域的共享位置29，19个内含子II共享一个U-to-C编辑事件。本研究讨论了一个候选RNA编辑因子，该因子与七个内含子中的V结构域保守序列非常匹配。

A. agrestis核PPR基因家族多样性

       HMMER图谱对A. agrestis组装的基因组进行扫描，鉴定了3089个编码PPR蛋白基因座。145个是P型的大多数是以PLS型，这是迄今为止确定的C-to-U RNA编辑因子的典型特征。1480个最初被评为“pure”PLS型PPR蛋白，缺乏可识别的额外羧基末端结构域，77个为E1结构域，447个为E1和E2结构域，928个为E蛋白。A.agrestis PLS型蛋白质系统发育树，该蛋白质被重新评估为延伸到E2结构域之外，因此包括典型的、发散的和截断的DYW结构域变体。

       A. agrestis 中扩展的 DYW 蛋白家族分成不同的进化枝，只有少数A. agrestis蛋白具有完整的DYW具有保守 N 端“PG 盒”的结构域，含 PGxSWIE 基序。A. agrestis 家族的大多数蛋白质 在具有全长但高度分化的 DYW 结构域的蛋白质超进化枝中，在保守氨基酸位置上具有特征性差异。超进化枝蛋白质以不同的 PG 盒 (‘KPAxA’) 为特征，分为“DRH”或“GRP”取代同名的 DYW 三肽“经典”DYW 域的结尾。在 KPAxA 超进化枝内，GRP 型数量相同，从 最近的DRH 型蛋白质中出现的基因家族。除了联合四个氨基酸缺失外，所有KPAxA型DYW结构域之间在氨基酸保守性方面存在许多差异，仅在GRP型DYW域中可以看到其他差异。

C-to-U和U-to-C RNA编辑的候选因素

        A. agrestis 中的大多数 DYW 变体蛋白，包括具有可识别 PG 框及其变体的截短本为主要编辑因子候选者。我们可以识别大量反向U-to-C RNA编辑，大量异常DYW结构域的蛋白质是有趣的。特征性DRH和GRP DYW结构域变体可能是代表反向U-to-C RNA编辑因子的有吸引力的候选者。使用不同 DYW 蛋白共有基序在 A. agrestis.中标识进化枝作为要扫描基因组和转录组数据。

       PPR阵列显示在KPAxA型蛋白质首选候选靶点中，U-to-C编辑位点占主导地位，PGxSWIE类型和WW类型变体上游的PPR阵列优先匹配C-to-U编辑位置上游序列。

       Cox1 mRNA中每个蛋白质中的PPR阵列与各自编辑位点上游的潜在靶点至少有13个完美匹配，WW型蛋白质与C-to-U编辑位点匹配，DRH和GRP蛋白质可能与U-to-C编辑位点上游结合。注意到在内含子II结构域V和VI内的RNA编辑位点中，结构域V一致位置29 U-to-C编辑事件在19个不同线粒体内含子II型之间共享。其中七个内含子在其上游结构域V序列中广泛相似性。

       GRP型DYW蛋白的PPR阵列与该共享U-to-C编辑位点上游的候选靶序列非常匹配。根据PPR-RNA识别代码规则，不仅可以观察到P型和S型PPR的匹配，还可以扩展到两个L型重复序列（L-5SN和L-8SN），它们可能与相应靶点中的保守腺嘌呤匹配。

讨论

       尽管角苔纲是现存陆地植物分支中最少的物种，但对理解胚胎植物的主干系统发育至关重要。Horneophyton化石可能代表苔藓植物和早期气管植物之间的“进化桥梁”，但是没有形态学或发育性突触形态确定现存的三个苔藓植物分支相对于气管植物的系统发育。最近大型核转录组数据集分析引发了讨论，质疑之前提出的苔类与其他胚胎植物及HT分支的姊妹系统发育。 A. agrestis 中细胞壁木葡聚糖或“化石”组内含子II的 rps3i74g2 的生化组成也可能支持 HT 进化枝，类似于 nad5i1477g2 内含子，或者可能是“反向”U-to-C RNA 的进化增益在陆地植物细胞器中进行编辑。然而，U-to-C编辑显然大量存在于角苔纲和蕨类植物中，甚至可能是嘧啶交换RNA编辑的主导方向。

       角苔很可能代表最古老的植物分支，其细胞器基因组中具有反向U-toC RNA编辑功能。因此认为它们是未来 U-to-C 功能研究的最佳选择RNA编辑，可能保留了“反向”的祖先特征编辑生物化学一个只有 84 Mbp 的小基因组——与大多数多倍体基因组形成鲜明对比蕨类植物——以及将其建成新植物的当前进展模型系统使A. agrestis特别对 U-to-C RNA 编辑的研究具有吸引力。

        A. agrestis 叶绿体和线粒体可以获得基因组及其完整的编辑组对于核基因组组装，角苔纲允许在嘧啶的两个方向上进行丰富的 RNA 编辑的相关性与潜在的特异性因子交换。 A. agrestis 中广泛扩展和多样化的 DYW 型 PPR 蛋白家族揭示了可能的祖先三个高度衍生的变体。值得注意的是发现目前确定的较大 KPAxA 进化枝 DRH 和 GRP 变体似乎在缺乏 U-to-C RNA 编辑的植物类群中没有同源物匹配 A. agrestis 中的反向 U-to-C 编辑位点。此外，U-to-C RNA 编辑的显著变异性，特别是在 Anthoceros 中可能会揭示有关编辑位点及其辅助因子共同进化的见解。

       尽管有数百个传统的 C-to-U 编辑以及更丰富的 U-to-C 编辑，我们发现了大部分C-to-U 编辑因子的典型 DYW 结构域在 A. agrestis 中被 C 端截断。被子植物模型中，这种截短被反式构象中提供的单独DYW结构域所补偿。有趣的是，A. agrestis基因组中的PPR基因家族PLS型具有保守的胞苷脱氨酶特征和末端 DYW 三肽。从转录覆盖率来看，这三个基因比PLS型蛋白表达更高。因此它们为 A. agrestis 中的许多截短蛋白质提供 DYW 结构域。单个多肽RNA编辑因子的破坏可能是独立发生的，也可能是HT分支的另一种突触形态。在 A. agrestis 中没有发现任何证据，然而被子植物中发现其他非 PPR“辅助”成分。相比之下，完整的全长DYW结构域定义的KPAxA型DYW蛋白占主导地位。尽管它们的氨基酸保守性曲线存在许多偏差，但Zn2+配位的胞苷脱氨酶特征在这些蛋白质中高度保守性，因此，尽管与更广泛的经典的“对应物”，KPAxA型DYW结构域不太可能使用完全不同的催化机制。

       比较植物的生活方式并不能给出合理的线索来解释为什么一些植物谱系完全失去了反向RNA编辑功能，可能一开始就从未拥有过反向RNA编辑功能或者为什么U-to-C编辑在其他谱系中主导C-to-U编辑。基于本文提出的假设，本文概述的实验方法有望回答这个令人费解的进化问题，例如，为什么RNA编辑在至少一些属中进化得如此之快比如Amaranthus、Silene 。