叶绿体基因组的比较分析揭示了药用植物冬凌草的系统发育关系和种内变异

       冬凌草(Hemsley) H. Hara (唇形科) 是一种传统的中药植物，已被用于治疗各种人类疾病和病症，如炎症、呼吸道和胃肠道细菌感染以及恶性肿瘤。然而， I的主要活性成分的含量。不同产地的冬凌草差异显着，极大地影响了其品质。因此，有一种分子方法来识别和分类I。需要冬凌草。在这里，我们报告了I的叶绿体基因组的 DNA 序列。冬凌草采集于河南庐山。该基因组长度为 152,642 bp，具有保守结构，包括一对 IR 区域 (25,726 bp)、一个 LSC 区域 (83,527 bp) 和一个 SSC 区域 (17,663 bp)。叶绿体基因组包含 113 个独特基因、4 个 rRNA 基因、30 个 tRNA 基因和 79 个蛋白质编码基因，其中 23 个包含内含子。蛋白质编码基因共有 24,412 个密码子，其中大部分是 A/T 偏向使用。我们确定了 32 个简单序列重复 (SSR) 和 48 个长重复。此外，我们通过比较三种Isodon物种的叶绿体基因组开发了有价值的叶绿体分子资源，mVISTA 和 DnaSP 分析均表明rps16-trnQ、trnS - trnG和ndhC-trnM是允许识别I内的种内差异的候选区域。冬凌草_ 此外，14 个候选片段可用于识别Isodon中物种之间的种间差异。使用最大似然法对荆芥亚科 24 个物种的完整叶绿体基因组进行系统发育分析，结果表明I . 冬凌草聚集在靠近我的地方。塞拉比我。lophanthoides。有趣的是，我们的分析表明I . 冬凌草（MW018469.1）来自陕西省咸阳市（IR-X），离我更近。serra比其他两个我。冬凌草种质。这些结果强烈表明I中存在种内多样性。冬凌草_ 因此，我们的研究结果进一步深入了解了等齿龙属物种的系统发育关系和种间多样性。

       近年来，大规模高通量 DNA 测序技术的快速发展和许多全基因组测序项目的实施，导致可用的基因组数据量大幅增加，基因组序列经常被用于确定系统发育关系、模式进化和遗传多样性。与线粒体和核基因组相比，叶绿体基因组对于这些类型的分析具有许多优势，例如体积小、核苷酸替换率低、单亲遗传和高度保守的基因组结构；因此，叶绿体 DNA (cpDNA) 被广泛用于物种鉴定和进化分析 。

       叶绿体是植物细胞中含有叶绿素的细胞器，它们通过光合作用将来自太阳的光能转化为化学能，为植物生长和发育所需的所有生化过程提供必要的能量 。叶绿体具有环状基因组，基因顺序和内容高度保守，大小在 120 到 160 kb 之间 。叶绿体基因组编码 110–130 个独特基因，其中包括许多光合蛋白、转移 RNA、核糖体蛋白和叶绿体 RNA 聚合酶基因 。典型的被子植物叶绿体基因组具有保守的四分结构，该结构由一个反向重复区域（IRA 和 IRB）的两个拷贝组成，由一个小的单拷贝区域 (SSC) 和一个大的单拷贝区域 (LSC) 隔开。叶绿体基因组高度保守，进化速度慢，不发生重组；因此，cpDNA可以反映亲缘关系和相关物种之间的进化关系。由于这些原因，叶绿体 DNA 已被广泛用于探索许多不同植物群中的系统发育关系。例如，通过分析它们的叶绿体基因组 比较了四种药用鼠尾草物种，并基于质体系统基因组学构建了唇形科的更新部落分类 。因此，对I的叶绿体基因组进行比较分析。冬凌草可以进一步深入了解Isodon属中物种的系统发育关系和种间多样性。

植物材料、DNA提取和DNA测序

       从I收集新鲜的叶子。河南中医药大学药用植物园种植的冬凌草属植物，该种质资源采集自中国河南省庐山市（ IR-L）。凭证标本存放于河南中医药大学药学院标本室。根据制造商的说明，使用快速植物基因组 DNA 分离试剂盒（Sangon，中国）从 100 mg 新鲜叶子中提取总基因组 DNA。DNA 浓度为 57.6 ng/μl，OD 260/280为 1.93，当通过琼脂糖凝胶电泳检测时，DNA 呈离散条带。随后，使用 Covaris Ultrasonic Processor 将 DNA 样品片段化，并使用 Hieff NGS ™ DNA 选择珠（Yeasen Biotechnology；目录号 12601ES56）进行片段浓缩和回收。Illumina DNA 测序文库是在末端修复、在片段的 3' 末端添加 dA、连接测序接头并使用 NEB Next ® Ultra ™ DNA Library Prep Kit for Illumina ®进行文库扩增后构建的（新英格兰 Bioldabs；E7370）。文库片段大小通过琼脂糖凝胶电泳确定，DNA 片段浓度用 Qubit 4.0 荧光计（Thermo Fisher）定量，文库 DNA 片段大小分布使用带有 DNA 1000 试剂盒（Agilent Technologies）的 2100 Bioanalyzer System 确定. 最后，合格文库在 Illumina Hiseq 2500 平台上以 150 bp 双末端 (PE) 读数进行测序。

基因组组装、注释和分析

       对于原始配对末端 Illumina 读数的质量控制，使用 FastQC 评估原始数据的质量，并使用 Trimmomatic 去除低质量的读数和接头序列。确定读取质量分数、序列 GC 内容和适配器内容等基本信息以评估数据质量。在获得高质量的测序数据后，参考已发表的I. serra叶绿体基因组 (MT317099.1)，我们使用叶绿体 DNA 样读数与 GetOrganelle v1.7.5 和 NOVOPlasty 组装序列以执行从头组装。NOVOPlasty 是一个从全基因组测序数据中组装细胞器基因组的程序，它能够组装部分重叠群并扩展它们，直到圆形基因组变得明显 。PrInSeS-G（版本 1.0.0. beta）用于纠正组装过程中发生的碱基错误和小片段的插入丢失 。反向 BLAST 搜索用于将组装的 cpDNA 与参考基因组或内置数据库进行比较，以优化和提取组装结果。叶绿体基因组使用 Dual Organellar GenoMe Annotator (DOGMA)  进行注释。基于与来自其他测序叶绿体基因组的同源基因的比较，手动校正假定的起始和终止密码子以及内含子位置。Hmmer v3.1b2 用于预测 rRNA 基因，aragorn V1.2.38 用于预测 tRNA，所有鉴定出的 tRNA 均通过 tRNAscan-SE 进一步验证。I的圆形地图. 冬凌草叶绿体基因组是使用 OGDRAW 1.3.1 版程序  绘制的。