大豆线粒体基因组揭示细胞间和系统发育水平的复杂基因组结构和基因进化

       确定线粒体基因组对于阐明种子植物的重要活动很重要。线粒体基因组对每个植物物种都是特定的，因为它们在进化过程中具有可变的大小、复杂的结构和基因丢失和增益的模式。与核和叶绿体基因组相比，这种复杂性使得大豆线粒体基因组的研究更加困难。本研究有助于解决 30 年来关于最复杂的线粒体基因组结构的谜团，表明许多大重复序列之间的成对重排可能会在种子植物中产生一个由 760 个圆圈组成的丰富分子库。除了 52 个功能未知的预测开放阅读框外，大豆线粒体基因组还包含 58 个功能已知的基因。基因组包含多个可识别来源的序列，包括 6 个。分别从核基因组和叶绿体基因组转移的 8 kb 和 7.1 kb DNA 片段，以及一些水平 DNA 转移。大豆线粒体基因组丢失了16个基因，包括9个蛋白质编码基因和7个tRNA基因；然而，它在进化过程中获得了五个叶绿体衍生基因。三种基因组中常见的四种 tRNA 基因来源于叶绿体。观察到大量 DNA 转移至细胞核，其中着丝粒周围区域为热点，包括分别从大豆线粒体和叶绿体基因组明确鉴定的 125.0 kb 和 151.6 kb 的 DNA 转移。大豆核基因组从其线粒体基因组中获得了五个基因。这些结果提供了对种子植物线粒体基因组的生物学见解。

       种子植物中线粒体基因组 (mtDNA) 的大小变化很大[1]、[2]，从白芥菜[3]中的 208 kb 到Silene conica [4]中的 11.3 Mb不等。然而，即使是最小的植物线粒体基因组也比动物大得多（通常约为 16 kb）[5]。种子植物中的线粒体基因组富含重复序列，例如串联重复序列、短重复序列和大重复序列[6] – [8]。短重复序列介导线粒体基因组的不可逆重组，从而导致基因组结构发生可遗传的变化[9]，[10]. 大的重复，通常大于 1 kb，可能介导线粒体基因组的可逆重组，调节基因组的分子构象，并可能反映或预测在植物能量代谢中起作用的基因组分子库的可能成分[11] . 在具有中等线粒体基因组大小的小麦 K 型细胞质雄性不育 (CMS) 系中报道了最大数量的成对大重复序列（9 对）[12]。最小的线粒体基因组（白芥菜）没有任何大的重复序列[3]。

       线粒体基因组大小、成对大重复序列的数量和结构组织因植物物种特有的线粒体类型而异。由于高等植物进化过程中基因的丢失和获得，能量产生所必需的已知功能基因的分布也显着不同[6]。线粒体基因组中未定义功能的预测开放阅读框 (ORF) 比已知功能的基因变化更大。预测的 ORF 在密切相关的进化枝[13]内的植物物种之间差异很大，通常在植物中表达，因此在植物的活动中具有一定的功能[6]、[13]. 然而，除了几个与 CMS 相关的 ORF 外，这些 ORF 还没有得到广泛的研究。

共存的有丝分裂型，包括主要和次要有丝分裂型[14] - [16]是种子植物中的最新发现。次要有丝分裂型通常难以检测，其拷贝数比主要有丝分裂型少几倍，并且在线粒体中没有明显的功能。然而，在某些与男性生育能力变化相关的条件下，次要有丝分裂型可能会变成主要有丝分裂型[17]。

       有限的研究表明，大豆 ( Glycine max ) 的线粒体基因组比许多其他基因组更复杂。电子显微镜显示，基因组有七个表观大小类别，平均长度不等[18]。通过限制性片段长度多态性分析[19]将大豆线粒体基因组分为四种类型，并检测到 4.8 kb 的大重复序列[20]。大豆线粒体基因组长度估计约为 392 kb [21]。最近，豆科植物（Vigna radiata、Lotus japonicus和Millettia pinnata）中的三个线粒体基因组已被鉴定[7]. 这些基因组相对于大豆具有相当简单的结构，可以作为大豆线粒体基因组的参考。

       大豆是全球最重要的作物之一，种植植物油和蛋白质。2010-2011年，其产量分别占世界主要油籽产量、主要蛋白粉和植物油产量的58.0%、67.9%和28.0% 大豆核和叶绿体基因组已发表[22]，[23]，大大增加了我们对大豆生物学的了解。尽管生物学家已经对大豆线粒体基因组进行了 30 多年的研究，但由于其复杂的结构，其序列仍然模糊不清。高通量测序技术为研究大豆线粒体基因组提供了一种有效的方法。在目前的工作中，高通量测序被用于获得种植在中国黄淮河流域大豆原产地的流行大豆品种的线粒体基因组的完整序列。该序列显示大豆线粒体基因组的结构是迄今为止测序的种子植物基因组中最复杂的。还揭示了大豆核、线粒体和叶绿体基因组之间的 DNA 转移。在构建具有 28 个代表性高等植物物种的线粒体基因组的系统发育树后，确定了基因丢失和获得。这里提供的数据代表了植物生物学的重大进步，尤其是在大豆研究方面。

      大豆 mtDNA 由 Roche 454 GS FLX 测序。生成了 15,861 个读取，覆盖 6,317,283 bp，并将数据组装成 33 个重叠群。用这些重叠群对已报道的大豆核和叶绿体基因组进行搜索[22]、[23]表明，测序覆盖深度低为 3-4 的重叠群中的五个（<500 bp）是污染 DNA：三个是核基因组序列两个是叶绿体基因组（cpDNA）序列。这些序列从大豆线粒体基因组的组装中移除。

      28 个重叠群中最长的为 73,279 bp。50% 分位数位置的重叠群长度为 31,090 bp（N50 值，在 Newbler 软件中定义）。最大contig长度和N50值都很大，说明测序数据足够好，可以组装基因组。bb.454contignet 软件用于加入 contigs 并获得连接图。为了验证重叠群的 36 个连接，我们设计了相应的引物（文件 S1 中的表 S1），并获得了所有 36 个引物组的预期条带。然后应用 Sanger 测序来验证组装。

       这些组装结果表明，其中 14 个 contigs 一次组装到线粒体基因组中，而其他 14 个 contigs 在 contigs 图上连接了两次或更多。这些结果表明某些序列在基因组中具有多个拷贝。使用 contig 3 作为组装的起点，我们在连接图上按顺序连接 contigs。然后生成了一个覆盖所有重叠群的基因组，其完整长度为 402.5 kb，这是基因组的单个主环。此外，我们分析了该基因组中重复区域的覆盖深度，发现推定的重复序列比单拷贝序列具有更高的覆盖深度，这进一步证明了重复的存在。由此产生的圆形主基因组涵盖了所有的基因组信息。