​国际权威学术期刊Plant Biotechnology Journal |多组学分析水稻模式触发免疫过程中的多层调控网络

多组学分析水稻模式触发免疫过程中的多层调控网络

文章简介

   期刊：Plant Biotechnology Journal

   通讯作者： 陈小林、刘文德

   IF：9.803（Q1）

   时间：2021年8月26日

   链接：https://doi.org/10.1111/pbi.13688

   导读：本文是中国农业科学院植物保护研究所刘文德课题组和华中农业大学陈小林课题组合作完成发表在《Plant Biotechnology Journal》（IF：9.803/Q1）题目为“Multilayer regulatory landscape during pattern-triggered immunity in rice”的文章。

在真菌和细菌的攻击下，植物通过识别病原体相关的分子模式(PAMPs)来防御病原体，从而启动模式触发免疫(PTI)。截至目前，已有一些报道采用单一或两种组合的组学策略研究植物的PTI响应机制，但通过多组学分析对PTI过程中重新编程的细胞过程缺乏系统的了解。本研究中，生成了代谢组、转录组、蛋白质组、泛素组和乙酰组数据，以研究水稻对两种PAMP，真菌来源的几丁质和细菌携带的flg22的PTI反应。建立了多层次调控网络为深入研究水稻以及其他相关作物中的PTI奠定了基础。

PAMPS的植物材料及处理：将水稻种子在介质中培养1周制备水稻幼苗，然后将水稻幼苗浸泡在8 nm几丁质或1 μm flg22溶液中不同时间，以用水处理的水稻秧苗为对照。对于免疫印迹实验(0、0.5、1、2、3和6h)和基因表达实验(3h)，使用三个生物重复进行评估。在转录组、蛋白质组、泛素组和乙酰组实验中，水稻幼苗在水、8 nm几丁质或1μm flg22处理3h后收获，每个处理在三个生物重复中各使用5株(3*5=15株水稻/处理)，在代谢组分析中，10个生物重复(10*5=50个水稻植株/处理)每个重复使用5个植株。

技术路线：

结果：

几丁质和Flg22诱导防御反应的多组学策略：

       几丁质或flg22处理后，ROS迅速爆发，峰值出现在5分钟(图1a)。MAPK3/6磷酸化水平显著升高，0.5h时明显升高(图1b)。我们还检测到在几丁质和flg22处理后3h，PR和防御相关基因(KS4、NAC4、PAL1和PAL2)的转录水平升高(图1c)。综上所述，这些结果表明，我们的实验系统适合于监测水稻PTI期间的生理反应。检测到来自37780个编码基因的41098个转录本，7377个蛋白质，839个乙酰化蛋白质和13903个代谢物(图1D)。此外，之前的研究中确定了2882种泛素化蛋白质(图1D)。

图1几丁质和flg22在水稻中触发的免疫反应的整合多组学网络分析框架。

为了确定PAMP处理引起的水稻变化，我们使用log2-fold changes比较了这五个数据集中的几丁质和flg22的响应，与水处理的对照样本相比(图2a，b)。我们发现，来自五个数据集的配对t检验的五个P值都低于0.0001，表明这两个PAMP对水稻有显著的影响。为了进一步确定水稻对几丁质和flg22的反应之间的相似性，进行了皮尔逊相关分析。水稻代谢产物中几丁质与flg22的相关性最小(R2=0.34)。通过比较，蛋白质组和乙酰组的相关系数分别为0.49和0.42。泛素组和转录组显示较高的R值，分别为0.62和0.63(图2c)，表明水稻在转录和泛素化水平上对几丁质和flg22的反应方式相对相似。

图2水稻对几丁质和flg22在多层调控中的严重反应。

       与对照组相比，发现几丁质处理的样品中有606个上调的质量特征和182个下调的质量特征(FDR<0.05；fold-change>2)，而在flg22处理的样品中发现了325个上调的质量特征和346个下调的质量特征(图3a)，这表明几丁质对水稻代谢的影响比flg22更强。然后，我们使用MetbraAnalyst 4.0版来注释几丁质和/或flg22在水稻中诱导的可能代谢物和相关途径。总共鉴定了113个显著差异的化合物。根据PubMed上的已知反应，生成了一个预测网络，说明了检测到的代谢物及其相关代谢物之间的潜在功能关系(图3b)。在几丁质处理的样品中，与能量代谢、核苷酸代谢、氨基酸、磷酸吡哆醛(PLP)和5-羟色胺相关的化合物受到影响。同时，在flg22处理的样品中，与己烷酸、丙酮酸和柠檬酸相关的化合物受到影响(图3b)。

图3深入的代谢组学分析确定了用几丁质或flg22处理的水稻的不同模式。

       在几丁质和flg22处理的样品中，分别有15条和9条途径在统计学上得到了富集(P-adj<0.05)，这支持了水稻在代谢组水平上对几丁质的反应比对flg22的反应更剧烈的可能性(图3c)。在几丁质和flg22样品中，淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢以及氨基糖和核苷酸糖代谢都较丰富(图3c)。苯丙烷类化合物的生物合成、抗坏血酸和醛酸代谢以及色氨酸生物合成等途径仅在几丁质处理的样品中得到丰富。我们还发现两种PAMP都显著抑制化合物脱落醛和羟基叶绿素(图3D)。相反，儿茶素和四氢呋喃被两种处理诱导(图3e)。这些受两种PAMP共同影响的化合物可被定义为对PAMP处理有反应的核心代谢物。

       比较了几丁质和flg22处理的水稻幼苗的转录本。在将clean reads与水稻参考基因组(IRGSP-1.0)进行比对后。对于差异表达基因分析(DEGs)(FC>±2，P-adj<0.05)，发现了531个几丁质特异上调的基因，656个仅由flg22上调的基因，以及287个共同上调的基因。还发现了240个几丁质的下调基因，260个针对flg22的下调基因，以及120个共同下调基因(图4a，b)。

图4. 几丁质或flg22处理后，水稻幼苗的转录组发生了很大的变化

       KEGG途径富集分析(P-ADJ<0.05)表明，两种PAMP都诱导了与糖酵解/糖异生、苯丙烷生物合成、类黄酮类生物合成、果糖和甘露糖代谢以及碳代谢相关的途径(图4c)。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及磷酸戊糖途径对几丁质有特异性反应(图4c，d)。亚油酸代谢和α-亚油酸代谢仅被flg22显著诱导，而几丁质未被显著诱导，这与代谢组分析结果一致(图3c)。为了在转录水平上阐明水稻对PAMPs的潜在反应，我们提取了与防御反应相关的DEG，并发现其中大多数在对几丁质和flg22的反应方面相似(图4E）。

蛋白质组和转录组的综合分析

       使用iTRAQ方法对几丁质、flg22和水处理的水稻幼苗样本进行了蛋白质组学分析。总共有7,387个检测到的蛋白质用于数据分析。比较了几丁质和flg22反应之间的差异表达蛋白(DEP)(FC>±1.5，P-adj<0.05；图5a，b)。如图5b所示，我们发现几丁质和/或flg22分别显著诱导了278、226和76个蛋白的表达。相反，几丁质和/或flg22分别显著抑制了297、274和107蛋白的表达。

图5. 全蛋白谱分析显示，PAMPs处理对水稻蛋白组有很大影响

       基因本体论(GO)富集分析表明，几丁质和flg22的DEPS都与防御相关的过程有关，如氧化还原、对压力的反应和对刺激的反应(图5c)。进一步的KEGG代谢途径富集化分析表明，两个PAMP处理都富含苯丙烷生物合成、乙醚脂肪代谢、氨基酸的生物合成、光合作用生物体内的碳固定和肌醇磷酸代谢(图5d，e)。仅在几丁质诱导的样品中，mRNA监测和精氨酸生物合成的代谢途径显著丰富(P-adj<0.1)(图5d，e)。果糖和甘露糖代谢途径仅在flg22诱导的样品中显著丰富(P-adj<0.1)(图5d，e)。这些结果清楚地表明，与水稻转录组相似，几丁质和flg22在翻译水平上诱导了类似的防御反应。

       PAMP处理后水稻蛋白质丰度的变化可以通过转录水平的变化来反映。为了验证这一想法，通过比较受两个PAMP影响的转录本和蛋白质的相对水平(log2FC值)进行了相关性分析，但发现在几丁质和flg22处理中转录组和蛋白质组反应之间的相关性非常弱(R2=0.15/0.21；图6a)。检测到一些基因作为对这两种PAMP的核心反应因子，显示出mRNA和蛋白质水平的趋同模式，进一步的富集分析表明，它们与膜结合囊泡、催化活性和脂质代谢过程密切相关(图6b)。这些结果表明，在水稻对几丁质和flg22的反应中，存在着显著的转录后和/或翻译后调控。

图6. 转录组学和蛋白质组学的综合分析

       通过结合转录组、蛋白质组和代谢组的结果(图6c)，确定了几丁质和flg22处理中富集的一些途径，如糖酵解/糖异生、苯丙烷生物合成以及氨基糖和核苷酸糖代谢。类黄酮的生物合成途径在DEG中显著丰富，但在DEPS或改变的代谢物中不明显，这表明可能存在转录后调控机制来调节这一过程。通过提供确定的DEG和DEP来可视化丰富的途径(图6d，e)。观察到，几丁质或flg22处理后，与苯丙烷类化合物生物合成相关的蛋白质丰度和mRNA发生了显著变化，这表明苯丙烷类化合物的生物合成途径在水稻对PAMPs的响应中是重要的。值得注意的是，在几丁质处理下，淀粉和蔗糖的代谢受到了mRNA和蛋白质水平的增加的控制(图6d)。这些结果表明，几丁质和flg22通过调节苯丙烷的生物合成以及淀粉和蔗糖的代谢来诱导类似的防御反应。几丁质诱导后通过降低蛋白质水平来调节乙醚脂肪代谢(图6d)。在flg22诱导下，肌醇磷酸代谢在mRNA和蛋白质水平上都受到影响(图6E)。综上，结果表明水稻在转录和翻译水平上对几丁质和flg22具有类似的正向激活苯丙烷类生物合成、类黄酮类生物合成和糖酵解/糖异生作用，但在代谢水平上的反应是不同的。

       几丁质和Flg22 PTI过程中翻译后蛋白的动态调节：此前，在一项比较的泛素组研究中发现了几丁质和flg22处理的水稻中动态的蛋白质泛素化，这表明泛素化对于PTI响应过程中的蛋白质丰度和功能很重要。为了测试这一想法，处理了以前的泛素组数据集，设置了阈值(P<0.05和FC>1.5)来定义几丁质和flg22处理的样本中的差异泛素化蛋白(DUP)。然后整合了蛋白质组和泛素组数据集，并观察到在蛋白质组学中检测到的许多DEP也是差异泛素化的蛋白(图7a，b)。这结果表明，水稻可能通过泛素化来调节这些蛋白质的表达或翻译，这可能解释了转录组和蛋白质组之间反应不一致的原因。其中，几丁质和flg22分别显著增加了23和14个上调蛋白的泛素化。同时，与9个在flg22处理中表现出相同丰度和泛素化模式的蛋白质相比，20个上调的蛋白质对几丁质的响应泛素化显著减少。此外，与flg22处理组的16种蛋白质相比，几丁质处理组中10种下调蛋白的泛素化程度明显更高(图7a，b)。

图7蛋白质与泛素化或乙酰化之间的关系。

       为了进一步了解水稻PTI过程中的其他PTMS，进行了全基因组乙酰组分析。用乙酰化蛋白的归一化强度鉴定差异乙酰化蛋白(DEAs)(图7c-e)。几丁质处理和flg22处理的水稻组织中分别有34和110个蛋白质乙酰化(P-adj<0.05，FC>±2)。经几丁质和flg22处理后，分别有43和6个蛋白质乙酰化程度明显降低。基于富集分析，观察到响应几丁质和flg22的差异乙酰化蛋白主要涉及核糖体亚基、核糖核蛋白复合体、含蛋白复合体、核小体、DNA包装复合体、翻译延伸和翻译(图S7a，b)。这些结果清楚地表明，乙酰化过程调节了在翻译调控中发挥重要作用的蛋白质，以调节基因的表达。还在差异乙酰化蛋白中发现了一些组蛋白(图7f)，这表明表观遗传调控也可能参与水稻的PTI反应。这些结果强调了复杂的翻译后修饰过程被用来调节水稻中的蛋白质丰度，以响应PAMPs。

       多组学分析揭示了与防御反应相关的代谢途径的详细趋同和分歧：在分析中，将变量与至少一个数据集中发生的数量变化进行了映射(图8)。苯丙烷类代谢中酶[6.2.1.12]、[1.14.1311]丰度的增加似乎是由转录增加所调节的，转录增加反过来又部分增加了相应代谢物的丰度(图8a)，在类黄酮的生物合成中，与酶反应相关的基因[2.3.1.74]，这是加工下游化合物的关键步骤，都被两个PAMP下调。这导致代谢产物显著增加，如松果膜素查尔酮、柚皮苷查尔酮和淫羊藿醇(图8b)。在糖酵解/糖异生途径中，几丁质处理的组织中α-D-葡萄糖-1P、α-D-葡萄糖-6P、草酰乙酸酯和丙酮酸的表达显著上调。同时，D-葡萄糖、甘油醛-3P、甘油-P和乙酰-辅酶A均被两种PAMP下调。水稻中α-D-葡糖1P的丰度在几丁质和flg22处理的样品中不同。然而，其衍生物β-D-果糖通过酶反应增加[2.7.1.11]，这与mRNA水平的升高有关。

图8调节网络与代谢途径的高分辨率映射。

       此外，在flg22反应蛋白中检测到泛素化水平降低(图8c)。同样，观察到flg22响应的草酰乙酸酯的丰度低于几丁质，而水稻调节与酶反应相关的基因[41.1.49]，将flg22响应的丙酮酸增加到与几丁质相同的水平(图8c)。在flg22处理的样本中，亚麻酸相关的通路被特异性地激活。在flg22反应过程中，基因表达负向调节代谢产物的丰度(图8d)。相比之下，在α-亚麻酸代谢中，在flg22处理的样品中，几乎所有的酶反应都被增强的转录激活，这与这一途径中八种化合物的丰度增加相关(图8e)。

结论：

       综合多组学分析发现了水稻对这些PAMPs的反应在多个调控层的趋同和分歧。水稻对几丁质和flg22的反应在转录组和蛋白质组水平上相似，但在代谢组水平上不同。

       研究人员发现这可能是由于翻译后的调控，包括泛素化和乙酰化，它们通过调节酶的活性来重塑基因的表达，并可能导致不同的代谢物谱。

       构建了代谢途径的调控图谱，包括与防御有关的苯丙素类和黄酮类生物合成以及亚油酸衍生物的代谢。

小结：

       在这项研究中，利用了代谢组、转录组、蛋白质组、泛素组和乙酰化组的数据，以研究水稻对两种PAMPs的反应，即真菌衍生的几丁质和细菌衍生的flg22。产生的多层次调控网络为深入剖析水稻和潜在的其他相关禾本科作物物种中的PTI奠定了基础。对于深入理解植物抗病过程具有重要的理论意义，同时对指导水稻抗病育种也具有重要借鉴意义。

对标产品：

       集思慧远有多年组学研究经验和专业的生信分析团队，可以完成上述研究中的所以组学分析。（年终预付款活动海报）