ADV SCI（IF15+）发文，二+三代测序突破病原检测瓶颈推荐理由：纳米孔测序有效提高临床样本中病原检测，为临床样本中RNA病原的无偏检测提供可能！！

     原名：Targeting RNA with Next- and Third-Generation Sequencing Improves Pathogen Identification in Clinical Samples

     译名：使用二代和三代测序靶向RNA可改善临床样本中的病原体鉴定

     期刊：Advanced Science

     IF：16.806/Q2

     发表时间：2021.10

     通讯作者：Jun Wang；Hongwei Zhou；Lixin Xie

     通讯作者单位：CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology Institute of Microbiology Chinese Academy of Sciences Beijing 100101, China；Microbiome Medicine CenterDepartment of Laboratory Medicine Zhujiang Hospital Southern Medical University Guangzhou, Guangdong 510282, China；College of Pulmonary and Critical Care Medicine Chinese PLA General Hospital Beijing 100853, China

     DOI：10.1002/advs.202102593

导读

       快速准确地识别微生物病原体对于正确治疗感染至关重要，临床上传统的基于培养的诊断越来越多地被宏基因组测序（mNGS）替代。二代测序的mNGS能极大的提高病原检测的效率，并且有助于识别难以培养的病原微生物，但其主要针对病原微生物的DNA。以牛津纳米孔技术（ONT）测序技术为代表的三代测序则拥有快速制备文库及超长读长等优势，能有效提高临床样本中病原的检测。本研究建立了RNA/cDNA靶向测序（mtNGS，使用二代测序技术的宏转录组），以减少临床样本中的宿主核苷酸比例，并通过与（ONT）相结合（mtTGS，使用三代测序技术的宏转录组）以提高测序时间。研究表明，与mNGS相比，mtNGS提高了微生物的检测比例，促进了细菌病原的鉴定，并能对真菌、病毒和抗生素抗性基因（ARG）进行检测，均有更好的覆盖度。此外，基于ONT的mtTGS由于其较长的读长优势进一步提高了病原微生物的鉴定，也加快了诊断的时间。同时，利用ONT的直接RNA测序和靶向测序的测试结果均表明，ONT具有重要的病原检测潜力，但仍需进一步发展。因此，这项研究表明在RNA基础上的临床病原诊断准确度、覆盖度和效率更高，有更高的应用潜力，特别是当与ONT的发展与技术更新相结合时。

实验设计

研究材料

       来自不同的感染诊断患者的62份样本，分别是39份支气管肺泡灌洗液（BALF）样本，14份血液样本和9份脑脊液（CSF）样本。

技术方法

       全部样本经Illumina NovaSeq(PE150) 进行mNGS及mtNGS测序，43份样本经ONT(mtTGS)测序，11份样本经ONT RNA直接测序（图S1）。后续Illumina和ONT数据统计分析均使用R(v3.6.1)进行。本研究中使用的R脚本和相关数据以及细菌注释bed文件已上载到GitHub

       (https://github.com/gaimingle10/PathIden)。

图S1：本研究中对样品进行测序的示意图

实验路线

结果

1、mtNGS在微生物分析效率上超过mNGSmtNGS

       对微生物分析的总体效率比mNGS更高。在微生物读数中，观察到含有核糖体的16S rRNA和23S rRNA的比例升高，这常用于解决细菌分类的问题（图1）。在共享的细菌物种中，mtNGS的微生物组成与mNGS有相当的一致性。在所有样品中的共享细菌物种有显著的相关性，其中16S rRNA（r2 = 0.055，p < 0. 05）（图1B）；23S rDNA（r2 = 0.091，p < 0. 05）（图1C）。考虑到单个细菌群体的多个系统发育标记，MetaPhlAn被用来计算不同细菌物种的丰度，并显示mNGS和mtNGS在微生物分析方面达到了相当大的相关性（在所有样品和单个样品类型中r2>0.3，除血液样品外所有p<0.05）（图1D）。结果表明，虽然mtNGS的效率有所提高，但与mNGS相比，它并没有导致微生物分析的明显偏差。

图1：关于mtNGS和mNGS之间的微生物读数比例测序效率和细菌丰度相关性

2、mtNGS改进了真菌、病毒和抗生素抗性基因(ARG)检测

       在病毒组分析中，mtNGS方法在所有样本中发现了1161种病毒（BALF中1086种，血液样本中450种，脑脊液中552种），而使用mNGS发现了694种病毒（BALF中666种，血液中179种，脑脊液中399种）。两种方法共同检测出来的病毒有619种，并且它们的丰度在不同类别的样本中显示出显着相关性（所有样本中 r2 = 0.31，BALF 中 0.33，血液中 0.42 和 CSF 样本中 0.21，均 p < 0.05）。更重要的是，mtNGS 中主要病毒组的相对丰度比 mNGS 高1到2个数量级，进一步证明了使用mtNGS进行病毒检测和分析的效率更高（图2）。另外，使用mtNGS分析鉴定了271种RNA病毒，包括已知的传染性病毒，如丙型肝炎病毒（基因型 1、2 和 6）、人类冠状病毒229E和人类副流感病毒3。

       mtNGS会提高检测真菌的效率。mtNGS和mNGS在共享真菌种类方面达到显着相关性（所有样本中 r2 = 0.26，BALF 中 0.56，血液中 0.26，CSF 中 0.021，除 CSF 样本外，所有 p < 0.05，图 3A，B），显示出 mtNGS 和 mNGS 在真菌分析方面的高度一致性。mtNGS识别ARG的效率更高。在mNGS中，所有样品中鉴定了1004个ARG（BALF中986个，血液中287个，CSF中385个），而mtNGS数据也显示所有样品中914个（BALF中885个ARG，血液中190个，CSF中347个），DNA和cDNA之间具有高度的相关性（在所有样品中，r2=0.33，BALF为0.41，血液为0.023，CSF为0.084）。尽管mtNGS与mNGS在发现的ARGs总数上没有很大的差别，但进一步检查发现ARGs的出现率较高（出现在52-97%的样本中，共61个ARGs）（图3C）。简而言之，mtNGS在发现高发生率的ARG方面比mNGS更有效，但不是整个ARG谱，这可能是由于它倾向于关注对抗生素压力有反应的高活性基因。

图2：mtNGS 与mNGS的病毒检测

图3：mtNGS 与mNGS 相比的真菌和ARGs检测

3、mtNGS 更符合使用传统方法进行的临床诊断

       为比较mNGS 和mtNGS 支持使用常规方法（主要是培养细菌病原体）进行临床诊断的能力，将本研究中使用的临床样本的基于培养的结果与mNGS和mtNGS 数据进行了交叉检验。在进行mNGS和mtNGS处理的所有样本中，42个样本的细菌培养结果为阳性，共鉴定出61株细菌。大部分来自 BALF 样本，有 29 个样本，其余来自 4 个血液样本， 9 个 CSF 样本。最常见的菌种是鲍曼不动杆菌（11 株）、金黄色葡萄球菌（8 株）和肺炎克雷伯菌（9 株），其余菌种在样本中总共分离不到 5 株。

       mNGS 使用 16S rDNA鉴定了一株肺炎克雷伯菌，而使用 23S rDNA 鉴定了四株菌株。相比之下，mtNGS使用 16S rRNA 鉴定了25株和使用23S rRNA 鉴定了40 株。在发现致病病毒方面，尽管临床上诊断的病毒/真菌病原体总体数量不多，但mtNGS的性能仍然超过了mNGS。同样，在真菌病原体方面，使用基于培养的方法，8个BALF样本被确认有9个分离的真菌，主要是白色念珠菌（4个样本）和酵母菌（2个样本）。在这里，使用18S rRNA作为遗传标记的mtNGS对酵母菌只进行了阳性鉴定，而mNGS不能阳性鉴定任何真菌病原体。

4、基于ONT的cDNA的mtTGS用于病原体分析

       在43个样本中，mtTGS每个样本产生73-550 Mb的总核苷酸，占相应mtNGS输出的近0.7-5.9%。微生物组成分析表明，mtTGS在测序效率方面有进一步的提高。在所有三种类型的样品中，可以比对到真菌（18S）的读数百分比显著增加，同时可以比对到MetaPhlAn中用于细菌鉴定的数据库的总读数也显著增加，都有很高的倍数变化（图4）。这种改进可能是由于ONT读数的长度较长（与mNGS/mtNGS的150bp成对端读数相比，平均读数长度为334.9-539.1bp），可以提高与参考数据库的整体比对率。

   在比较所鉴定的细菌和真菌时发现，基于宏转录组学的方法在不同平台上具有高度一致性。此外，在使用多种标记或基因组序列时，测序方法之间的总体高度一致。然而，对于ARG基因来说，这种一致性无法建立，因为mtTGS只鉴定了mtNGS中鉴定的0.0056-13%的ARG基因。据推测，这是由于ONT平台的输出量相对较低，导致mtTGS的读数较少（只有mtNGS中的0.2-15%），导致无法发现低丰度的基因。

最后，通过mtTGS对前面提到的临床诊断和鉴定进行交叉检验，证实与mtNGS相比，MetaPhlAn数据库的比对率较高，进一步提高了阳性发现率。这种改进归因于更高的读数长度，因此与参考数据库的比对率也更高，有利于对属于这些病原体的读数进行正面识别。至于每个样品中的序列丰度，mtTGS的结果显示，即使使用16S和23S等单一标记，也能提高检测率，这归因于序列长度的增加；但使用多标记（MetaPhlAn）似乎有点问题，这可能是由于ONT读数的高错误率，从而导致个别标记基因的误识别。在发现病原真菌方面，mtTGS通过使用18S标记显示出更高的检测率。而在病原体病毒检测方面，mtNGS也比mNGS和mtTGS这两种方法更敏感。

图4：对 mtTGS（绿色）、mtNGS（红色）和 mNGS（蓝色）的每种单独类型的样本（n = 43）计算微生物读数（细菌、真菌和病毒）的比对率

5、使用ONT平台对临床样本进行直接RNA测序

ONT提供了直接测序RNA的能力，而不需要事先进行cDNA合成和PCR扩增，理论上可以减少cDNA合成造成的偏差，大大提高微生物RNA的测序速度。然而，直接RNA测序目前面临着临床样本中总RNA量相对较少的情况，每个样本的总核苷酸为12-11500kb。直接RNA测序的低产出主要是由于来自临床样本的起始RNA数量少。

   直接RNA结果的微生物读数比例高于mtNGS的结果。目前还不清楚这些差异是在逆转录和扩增过程中引入cDNA的偏差，还是直接RNA测序对微生物读数的偏差。微生物读数比例的提高也导致每种样品类型中比对到16S、23S和MetaPhlAn标记以及18S和病毒基因组的读数比例总体较高。观察到可以比对到细菌的读数比例显著增加（图5）。

   直接RNA测序被扩展用于COVID-19患者的SARS-CoV-2病毒的诊断和基因组分析，并证明直接RNA可用于这一重要RNA病毒的诊断。受RNA读数总数的限制，加上SARSCoV-2的丰度极低，无法对该病毒进行深入的基因组分析。然而，即使是使用Illumina测序的更成熟的方法也有这种限制，其中SARS-CoV-2病毒基因组的定向扩增是必要的，以达到进一步分析的基因组的适当覆盖。

图5：直接RNA测序进一步提高了比对率

6、通过使用ONT进行诱导测序进一步去除宿主的cDNA

此外，为弥补使用ONT平台的cDNA（以及潜在的直接RNA测序）相对较低的产出，通过进一步增加微生物读数的比例来应用定向测序。ONT能够利用 "read-until "策略，当部分序列的读数与定义的数据库相匹配时，相应的测序纳米孔中的电流可以逆转，对特定读数进行测序终止。使用宿主基因组和转录组作为参考，从ONT cDNA测序中去除部分宿主cDNA读数，可能会进一步提高最终测序结果中微生物cDNA的比例。因此，试验了基于ONT的靶向测序的两个最新进展Readfish和UNCALLED以考察mtTGS的靶向测序的性能。

与ONT mtTGS的结果（平均93.97%的宿主读数）相比，观察到Readfish的cDNA靶向读数（平均93.15%的宿主读数）时，宿主读数有可察觉的减少，但幅度很小。另一方面，UNCALLED在测序结果中的宿主读数平均为96.76%。因此可以得出结论，在现阶段，这样的 " read-until "策略还不能明显改善cDNA测序，可能是因为这两种方法最初是为长读数测序而开发的，而在mtTGS测序过程中，对于相对较短的cDNA读数（只有数百bp），在识别目标读数和随之而来的移除之间没有足够的时间。因此，这种策略可能需要进一步改进计算方法和硬件，才能有效地应用于临床样本和使用cDNA甚至RNA的微生物分析。

结论

一、与mNGS（二代测序技术的宏基因组）相比，mtNGS提高了微生物读长的比例，促进了细菌病原的鉴定，并能对真菌、病毒和抗生素抗性基因进行检测；

二、基于纳米孔ONT的mtTGS其长读长的优势进一步提高了病原微生物的鉴定，也加快了诊断的时间；

三、利用ONT的直接RNA测序和靶向测序的结果表明其具有重要的病原检测潜力，但仍需进一步发展；

四、该研究表明靶向RNA的临床样本病原检测有更高的潜力，特别是当与ONT的发展和技术更新相结合时。

       总之，本研究展示了RNA靶向测序、mtNGS和mtTGS用于微生物分析的前景，特别是在临床环境中，它们在测序效率方面超过了目前基于DNA的方法（mNGS）。使用直接RNA测序的进一步改进显示了初步的潜力，随着可预见的平台成熟，可以预计它将被用于更广泛的应用中。

小编点评：

       以牛津纳米孔测序技术（ONT）为代表的三代测序拥有快速制备文库及超长读长等优势，能有效提高临床样本中病原的检测，而ONT直接RNA测序技术也为临床样本中RNA病原无偏的检测提供了可能。另外，mtNGS相比mNGS（主要使用Illumina平台）只是增加了逆转录部分，只产生非常有限的额外成本，以减少临床样本中的宿主核苷酸比例，并通过与ONT相结合（mtTGS（使用三代测序技术的宏转录组））以缩短测序时间。