绝对定量限时优惠来袭，一文教你玩转qPCR

我们知道，qPCR方法一般分为相对定量和绝对定量。相对定量能够得到某一个基因在不同样品中表达量的差异，是相对比例。但如果想知道某个基因在每个样品中具体的拷贝数或浓度，则必须用绝对定量来做。

绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算末知样品的量，可测定目标核酸分子的实际拷贝数，但也是最费力、最复杂的定量形式。此方法要求稳定的标准品和高度准确的标准曲线。

应用领域

检测基因拷贝数（土壤中细菌、真菌、固氮菌等含量的检测和功能基因检测）；检测样品中目的基因或序列的绝对拷贝数；检测基因拷贝数变异(CNV)等。

绝对定量实验的重中之重便是标准品的制备以及标曲的绘制了，一个稳定的标准品以及高度准确的标准曲线能最大限度地提高实验一致性及检测结果精准度。

那么如何制备标准品呢？

公司目前采用的是质粒克隆的方式制备DNA 标准品，相较于一般的PCR扩增片段标准品更加稳定，适宜长期保存。

DNA标准品制备方法：将目的片段进行PCR扩增，回收目的条带后连入T载体，再进行质粒提取，根据OD值定量后进行梯度稀释，获得一系列不同浓度的标准品。

小TIPS：将标准品低温储存，以后可以重复使用哦！此外最好使用与实验样本尽可能类似的目标模板，以及相同的实验条件，以减少误差。

有了标准品下面就可以绘制标准曲线啦！

使用标准曲线进行绝对定量

首先根据公式质粒拷贝数(copies/μL)=6.02×1023(copies/mol)×质粒浓度(g/μL)/质粒分子量(g/mol)，得出质粒拷贝数。

最后根据各样品的拷贝数及相应的Ct值绘制标准曲线，得到线性方程Ct= -klgX0+b，其中X0为起始模板量。然后将未知样本的Ct值与此标准曲线进行比较，确定其拷贝数浓度。

扩增曲线和标准曲线

小TIPS：注意每一次定量实验，都必须将标准品与待测样品在一块板上同时检测哦。

虽然原理简单，但这项实验还是比较费时费力的，想要节省时间与精力的老师可考虑我们集思慧远绝对定量检测服务。

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绝对定量检测流程

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