微生物测序该怎么选，扩增子测序 or 宏基因组?

宏基因组测序

宏基因组测序 (Metagenomics Sequencing) 是对样本中（土壤、粪便、肠道、水体等）微生物总DNA进行测序。主要研究微生物群落结构多样性、基因功能活性，解析微生物功能与环境之间的关系，是微生物群落研究的有效手段之一。

扩增子测序

扩增子测序是指利用合适的通用引物扩增环境中微生物的16S rDNA / 18S rDNA / ITS或功能基因的序列（某一段可变区（如16S V3+V4，16S V4+V5，16SV4，18SV4，ITS1，ITS2等）），通过二代高通量测序技术检测PCR产物的序列变异和丰度信息，分析该环境下的微生物群落的多样性和分布规律。主要优势在物种多样性层面。也可以使用PICRUSt等软件通过比对16S测序数据获得的物种组成信息，预测其功能基因组成，从而分析不同样本或分组之间在功能上的差异。但是通过某一两个可变区域预测物种的多样性，存在一定的误差，一般只能注释到“属”水平。

宏基因组适用研究范围：

微生物种类众多，广泛涉及食品、医药、工农业、环保等诸多领域。因此，宏基因组测序（mNGS）技术的应用领域也是相当广泛。

宏基因组测序是精细鉴定微生物群物种组成和挖掘菌群基因功能的首选工具。相比于扩增子测序，宏基因组测序具有两个非常突出的优势：

1. 鉴定到的菌群组成信息更丰富，分类学鉴定更精细，可以精确鉴定到species（种）水平，甚至到strain（株）水平，精细锁定关键物种利于下游机制实验。

2.直接鉴定菌群携带的基因，既能借助数据库对基因功能进行多维度注释，又能进行差异基因分析，利于深度发掘菌群发挥功能的分子机制。

结合个性专业数据库，丰富功能分析角度

提供六种数据库全面挖掘微生物群落的功能特征以及群落内基因间的潜在关联、代谢网络等。

KEGG：广泛应用的基因功能注释方面的综合性数据库，包括基因的功能、分类、代谢通路等信息；

eggNOG：基于直系同源进行基因、蛋白序列功能预测；

CAZy：碳水化合物活性酶相关的专业数据库，对生物质转化、生境内碳循环相关功能研究有重要参考价值；

PHI：病原宿主互作数据库。收录的都是经过实验验证或文献报道的具有毒力和效应基因的细菌、卵菌、真菌，宿主包括动物、植物和真菌；

CARD：抗性基因数据库，通过该数据库的注释，可以得到相应的抗性基因注释结果，能够看到基因的抗性类型、机制等信息；

VFDB：病原菌毒力因子数据库，为病原菌的入侵机理研究提供关键证据，广泛应用于毒力因子基因鉴定；

通常我们会通过NCBI、KEGG等公共数据库来进行基因组的注释分析，但有时会发现分析结果没有针对性，想要研究却无从下手。这时不妨换个专业数据库来试试，或许能得到不一样的结果，从而踏上“不一样”的科研之路，发更高分的文章

在了解了宏基因组测序有哪些强势后，下面给大家整理了宏基因组常应用三大方案，具体案例说明用好宏基因组测序，提升微生物组研究的档次。

方案一 已经做了16S测序，还能怎样提升微生物组研究档次

微生物组的研究，停留在16S测序数据的多样性分析是远远不够的。只有揭示菌群所发挥的功能，才能进一步解释菌群与宿主间关系乃至作用机制。

此时，使用宏基因组测序，可以进一步获取菌群携带的基因信息，分析菌群参与的功能和通路，16S+宏基因组的组合既可以通过组学一致性验证文章可靠性，还可以大大提升微生物组文章研究的深度。

研究案例

【Microbiome】浙江大学农学院李红叶教授团队揭示植物叶际微生物组应对病原菌入侵的响应及潜在机制

译名：植物叶际微生物组应对黑素糖病原体入侵的响应及潜在机制

原名：The phyllosphere microbiome shifts toward combating melanose pathogen

发表期刊：Microbiome

影响因子：16.837

实验分组：受感染叶片、未受感染叶片

主要技术：16s测序、宏基因组、微生物分离培养

                                                                                             技术流程

植物可以招募有益微生物来增强其抵御病原菌的能力，然而相比于根际微生物组在抑制植物病原菌的大量研究中，有关叶际微生物组在抵御病原菌时的整体群落的变化还不清楚。

目的：（1）描述受感染和未受感染叶片之间叶际微生物组的转变；

（2）研究叶际微生物组成员在病原体攻击时是否以及如何对植物产生积极影响；

（3）为植物生态位提供额外的证据，以支持植物的“呼救”策略。

结果：

本研究结合扩增子测序、宏基因组测序和依赖于培养的方法，以及体外、体内的双重培养试验，系统研究和比较自然田间条件下柑橘树受柑橘砂皮病菌和未感染叶片之间的叶际微生物群落。

扩增子测序结果表明，染病叶片的叶际微生物组发生了变化，主要表现为叶片内生细菌群落均一性显著减少，且有大量新类别的微生物出现，以及微生物间的互作也更为密切。

宏基因组测序得到的基因KEGG功能注释，以及为研究差异富集的代谢通路中的某些特殊功能，将宏基因组测序数据与CAZy数据库进行比对，从功能的角度对受感染叶片的微生物组特征进行了鉴定，结果表明，差异富集的通路多为代谢相关通路（差异富集的前10个通路中，6个与代谢相关），且具有丰富的铁竞争功能和有益的基因组特征的高丰度富集的鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas spp.），以及具有潜在抗真菌特性的粘杆菌（Mucilaginibacter spp.）在染病的叶面富集。

                                                                                                                    微生物组功能分析

温室实验表明，与微生物组转变相关的几种细菌可以在柑橘砂皮病菌挑战下对植物性能产生积极影响，病害指数降低 65.7% 至 88.4%。其中，Pantoea asv90 和Methylobacterium asv41被鉴定为感染叶片中“招募的新微生物”，在体外和体内均表现出对柑橘砂皮病菌的拮抗活性，包括抑制孢子萌发和/或菌丝体生长。鞘氨醇单胞菌属表现出有益的基因组特征，并被发现是受感染叶片中铁络合物外膜受体蛋白功能富集的主要贡献者。此外，Sphingomonas asv20 在缺铁条件下对柑橘砂皮病菌的抑制能力比在铁充足条件下更强，表明铁竞争在它们的拮抗作用中发挥了作用。

方案二  多组学联合

——适用于复杂的作用机制、表达代谢相关的研究，Biomarker筛选

研究目的：从基因组层面、转录表达层面以及代谢层面研究环境样本中微生物群落的功能。

以微生物组+代谢组联合分析为例，可以对微生物群落结构差异、微生物代谢变化、宿主代谢变化、以及微生物群落结构差异和代谢变化对宿主代谢活动的影响等多个维度进行研究，全面解析微生物-代谢物-宿主之间的相互作机制，为筛选相关的代谢标志物及微生物群落作用奠定基础。

研究案例

译名：粪便宏基因组+血清代谢组学联合分析揭示肠道微生物相关代谢物在结直肠癌及腺瘤诊断中的应用价值

原名：Integrated analysis of the faecal metagenome and serum metabolome reveals the role of gut microbiome-associated metabolites in the detection of colorectal cancer and adenoma

发表期刊：Gut

影响因子：31.793

实验分组：正常对照组（N组）、结直肠癌患者（C组）、腺瘤患者（A组）

主要技术：宏基因组学、非靶代谢组学、靶向代谢组学

                                                                                       技术流程

目的：分析血清中与肠道微生物组相关的代谢物，并研究这些代谢物是否可以区分患有结直肠癌 (CRC) 或腺瘤的个体与正常健康个体。

结果：总共有 885 种血清代谢物在 CRC 和腺瘤中发生了显着改变，其中包括 8 种肠道微生物组相关血清代谢物（GMSM 组），通过靶向和非靶向代谢组学分析可重复检测到这些代谢物，并准确区分了正常样本中的 CRC 和腺瘤。用于预测 CRC 和结直肠腺瘤的基于 GMSM 小组的模型在建模队列中产生的曲线下面积 (AUC) 为 0.98（95% CI 0.94 至 1.00），在模型队列中的 AUC 为 0.92（83.5% 敏感性，84.9% 特异性）验证队列。在验证队列中的样本中，GMSM 模型显着优于临床标志物癌胚抗原（AUC 0.92 vs 0.72），并且还显示出对腺瘤（AUC=0.84）和早期 CRC（AUC=0.93）的有希望的诊断准确性。

结论：

（1）结直肠癌（CRC）患者的肠道微生物组重编程与血清代谢组的改变有关，肠道微生物组相关血清代谢物（GMSM）的变化可以有效地将CRC和腺瘤患者与正常个体区分开来。

（2）该研究开发了一种GMSM的模型，可以比癌胚抗原（临床标志物）更有效地将CRC和腺瘤患者与健康的正常受试者区分开来。

整合粪便宏基因组和血清代谢组分析，研究肠道微生物组相关的血清代谢物在异常结直肠患者中的显着变化

方案三：比较宏基因组——处理环境的影响；时间序列演进

研究目的：不同环境、不同处理的样本中微生物群落结构和功能的差异，以及和环境/临床因子的关系。

研究案例

译名：宏基因组学揭示了黑土地区长期添加化肥和有机肥下土壤碳氮循环的不同功能特征

原名：Metagenomics reveals divergent functional profiles of soil carbon and nitrogen cycling under long-term addition of chemical and organic fertilizers in the black soil region

发表期刊：Geoderma

影响因子：7.422

实验分组：长期化肥和有机施肥对东北黑土区南部、中部和北部3个试验点土壤

主要技术：宏基因组、理化检测

结果：生物地理距离对土壤碳氮循环中微生物功能的影响最大，3个试验点的施肥效果均显著。施用有机肥增加了携带C和N循环基因的变形菌门（Proteobacteria）和浮霉菌门（tomycetes）的相对丰度，抑制了Verrucomicrobia等寡营养类群的生长。

施用有机肥增加了甲烷氧化相关基因的丰度，但对土壤C的降解和固定影响不大。有机肥特别是与化肥联合施用（CFM）显著降低了cooC (reductive acetyl-CoA pathway)和coxS (CO氧化)的丰度，而提高icd (rTCA cycle)的丰度。

化肥增加了黑土氮素降解、硝化和厌氧氨氧化的基因丰度，而施用有机肥则有利于黑土氮素的同化和异化还原功能。但CFM显著提高了土壤反硝化潜力，这可能是由于该地区氮素输入过多，氮素通过排放氮气导致土壤氮素流失。

有机肥对土壤磷含量的显著提高主要影响了土壤碳氮循环特征、功能基因丰度和微生物类群。不同碳氮循环基因间的相关关系表明，黑土碳氮代谢潜力存在协同或拮抗相互作用。综上所述，本研究深入揭示了长期施用化肥和有机肥对黑土区农业生态系统土壤养分循环的影响。

                                                     参与土壤C（a）和N（b）循环的微生物功能谱

                                                           基于元基因组测序的不同碳循环过程

                                                           基于元基因组测序的不同氮循环过程

               

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