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喜树碱是一种广泛用于治疗各种癌症的化疗药物。短小蛇根草（Ophiorrhiza pumila）是研究喜树碱生产的理想植物模型，在研究喜树碱的生物合成和调控方面具有多种优势。作为转录因子 (TF) 的一个大家族，WRKY转录因子在植物次生代谢物生物合成中具有关键的调节作用。文章首次在全基因组水平分析了短小蛇根草WRKY转录因子家族，证实了OpWRKY6是短小蛇根草中喜树碱生物合成的负调节因子，为探索喜树碱植物中WRKY家族成员的特征和功能提供了有价值的基因信息。

原名：Identification of WRKY transcription factors involved in regulating the biosynthesis of the anti-cancer drug camptothecin in Ophiorrhiza pumila.

译名：短小蛇根草中参与调控抗癌药物喜树碱生物合成的WRKY转录因子的鉴定

期刊：Horticulture Research

IF：7.291/Q1

发表时间：2022.4.22

作者单位：浙江中医药大学

技术方法

全基因组鉴定，转录组测序，qPCR，亚细胞定位，基因过表达/敲除，高效液相色谱 (HPLC),酵母单杂交（YIH）,双荧光素酶报告检测（Dual-LUC）

研究结论

01短小蛇根草WRKY家族的鉴定

使用WRKY结构域（PF03106）对O.pumila基因组进行HMM搜索，获得了46个OpWRKY基因。OpWRKY1-3之前曾报道过，OpWRKY4-46是根据它们在O.pumila基因组序列上的位置命名的。同时统计了各OpWRKY成员的亚细胞定位、氨基酸长度、分子量(MW)和等电点(pIs)等理化性质。

02物种内及物种间共线性分析

46个OpWRKY基因不均匀分布在O.pumila的11条染色体上。在O. pumila基因组中发现了7个 OpWRKY基因对，它们位于不同的染色体上，表明这些区域的片段重复可能有助于OpWRKY家族的扩张。作者将短小蛇根草与水稻、拟南芥、葡萄以及咖啡4个物种做了共线性分析，其中短小蛇根草与咖啡共线性关系最多(40)，其次是拟南芥(34)。

03OpWRKY蛋白的系统发育分析

根据系统发育和多序列比对分析将OpWRKY蛋白分为三个亚家族。10个成员属于I组，包含两个WRKY域；第II组由31个OpWRKY蛋白组成，并进一步分为5个亚组；III组共有五个OpWRKYs成员，这些成员都包含一个WRKYGQK结构域和一个C2HC型锌指基序。

04OpWRKY的基因结构和保守基序分析

将系统发育树、基序组成以及外显子-内含子结构构建到一起，OpWRKY具有相似基因结构和基序组成的基因总是聚集在同一类中，如基序3、4和9仅在I型组中发现，而基序6、7和8仅在组II中检测到；包含三个外显子和两个内含子的组IId和III，该结果也支持了系统发育的分组结果。

05OpWRKY基因的共表达网络分析

使用转录组表达量数据，绘制OpWRKYs和喜树碱生物合成基因在不同组织中的表达热图。与大多数喜树碱生物合成基因一致，大部分OpWRKY基因在根中的表达水平最高。并将两者构建了一个共表达网络，发现20个OpWRKY与喜树碱生物合成基因强相关，其中OpWRKY6基因相关性尤为显著，该结果表明OpWRKY6可能参与调节喜树碱及其前体生物合成。

系统发育树表明OpWRKY6与AtWRKY43在IIc组中聚类并包含一个保守的WRKY结构域。OpWRKY6-YFP融合蛋白的亚细胞定位表明它仅定位于本氏烟草叶细胞的细胞核。这些结果表明，OpWRKY6作为细胞核中的TF调节转录。

06OpWRKY6负调控O.pumila中喜树碱的产生

针对候选基因OpWRKY6进行转基因功能验证，发现OpWRKY6的过表达显著降低了喜树碱的积累。相反，OpWRKY6敲除系中喜树碱的积累增加。

进一步通过酵母单杂交（YIH）和双荧光素酶报告检测（Dual-LUC）实验等表明，OpWRKY6通过直接负调控环烯醚萜和莽草酸途径的基因（如OpGES、Op10HGO、Op7DLH和OpTDC）的表达进而抑制喜树碱的生物合成。

结论   / conclusion文章共鉴定出46个OpWRKY基因，不均匀分布在O.pumila的11条染色体上。系统发育和多序列比对分析将OpWRKY蛋白分为三个亚家族。基于不同组织表达和共表达结果，筛选出候选基因OpWRKY6。通过实验验证得出OpWRKY6在O.pumila中调节喜树碱生物合成的模型：OpWRKY6转录因子通过直接结合和抑制莽草酸途径（OpTDC）和环烯醚萜途径（OpGES、Op10HGO和Op7DLH）中的生物合成基因来负调控喜树碱的生物合成。

小编点评

近期高质量的O. pumila基因组的发表为全基因组鉴定分析和研究WRKY基因的功能提供了机会。根据以往研究，一些WRKY家族基因，如OpWRKY2、OpWRKY3在喜树碱的生物合成中发挥作用。于是作者便选择OpWRKY作为研究课题，首先是大篇幅的基因家族分析，分析了家族成员的染色体位置、共线性、分类、进化和表达模式等，筛选出候选基因OpWRKY6。并通过酵母单杂交、双荧光素酶报告检测等实验，阐述了OpWRKY6调控喜树碱的生物合成的分子机制，非常的全面，发到了一区7.291分，非常值得借鉴。

文章链接：https://doi.org/10.1093/hr/uhac099