经典案例|球等鞭金藻的完整线粒体基因组分析

Sarah：藻类的线粒体基因组已测很少，您是否有考虑捷足先登研究一下呢，怕不好分析吗？对这方面不太了解，测了也不知道怎么写？来吧，看看这篇文章！小编必须用 扎 实 来形容它，这是一篇研究类型的文章，却有着类似综述一般讨论，严谨全面，不怕你学不到，若是你想积累文献，也可以根据本文来检索哦。

原文标题：The complete mitochondrial genome of Isochrysis galbana harbors a unique repeat structure and a specific trans-spliced cox1 gene译名：球等鞭金藻的完整线粒体基因组-重复结构和特定的反式剪接cox1基因

期刊：Frontiers in Microbiology

IF: 6.064(Q1/2区)

作者单位：福建师范大学生命科学学院

文章链接： https://doi.org/10.1186/s12864-022-08706-2.https://www.frontiersin.org/articles/

10.3389/fmicb.2022.966219/full

 Sarah：在进入文章之前，小编还是耗费一点文字对藻类百科一下。藻类，又称作悬浮植物，包括数种不同类以光合作用产生能量的生物，其中有属于真核细胞的藻类，也有属于原核细胞的藻类。藻类涵盖了原核生物、原生生物界和植物界。原核生物界中的藻类有生活在无机动物中的原核绿藻。属于原生生物界中的藻类有裸藻门、甲藻门（或称涡鞭毛藻）、隐藻门、金黄藻门（包括硅藻等浮游藻）、红藻门、绿藻门和褐藻门。而生殖构造复杂的轮藻门则属于植物界。（X门、X纲、X目、X科......文中各样名词着实一度难倒小编，翻译如有差错，欢迎大家指正。）

引言

单细胞球等鞭金藻是定边金藻门等鞭金藻科的一个物种。它被认为是人类和动物食品补充剂的理想天然来源，因为它含有丰富的有价值的生物活性化合物，如岩藻黄质和多不饱和脂肪酸。此外，它的高饱和酸有助于提高可再生能源系统中生物柴油的质量。因其基因组小且杂合度低(~93M)、合适的细胞大小(5-7μm)、无细胞壁、高生长速度和较短的寿命等特点，使其成为解决有关遗传和基因组的许多生物学问题的极具前景的微藻模型。

球等鞭金藻高质量的核基因组和完整的叶绿体基因组已有报道。然而，直到最近，人们对它的线粒体基因组特征知之甚少。

研究内容/技术路线 

实验结果

线粒体基因组特征

球等鞭金藻的最终完整线粒体基因组为一个长39,258bp的环状双链DNA分子，总AT含量为72.95%(图1)。该线粒体基因组包含一大片段重复序列(~12.7kb)，几乎占总基因组大小的三分之一。

该基因组在编码区表现得相对紧凑，编码46个基因，其中44个是独有的，包括20个蛋白质编码基因，24个tRNAs(22个独有)和一个分裂的核糖体操纵子，包括编码rRNAs的小亚基(16S或rrnS)和大亚基(23S或rrnL)的基因，没有检测到5S rRNA基因(图1)。发现一个功能未知的新基因，命名为orf110。同时作者对编码区的占比、各基因的起始密码子和终止密码子的使用情况、tRNA数量、不同氨基酸占比、基因转录方向等进行了统计描述。

分析20个蛋白质编码基因的编码序列，计算密码子偏好性(RSCU)。根据A/T在密码子中的位置，发现A/T更多位于每个密码子的第三位(83.13%)，其次是第二位(65.80%)和第一位(64.44%)。

大片段重复区

几乎所有已测的定边金藻的线粒体基因组都含有高度重复的非编码区域，除了定鞭金藻目的小金色藻(表1)。通过人工验证，整个重复区域可以被任意分为两个大的串联重复序列和一个小的串联重复序列(图1)，第一个大重复序列(Repeat I：20,165-27,632)的长度约为7.5kb，它由几个串联重复序列块组合而成，根据每个亚基内序列的相似性，任意划分为A、B和C，具有95%的同源性(图1)。第二个大重复序列(Repeat II：27,743-32,669)的长度约为5.0kb，另外一个约0.3kb的小串联重复序列位于重复序列I的上游，其单位与A和C亚基有一定的同源性。重复序列I以A-B和A-C两种模式为主，A-B为主要模式，全长6,514个碱基，占重复序列I的87.23%；A-C模式占重复序列I的12.77%，总长度为954个碱基。

同时，作者还探讨了重复序列对定边金藻线粒体基因组编码基因分布紧凑程度的影响。差异重复单位扩增是藻类线粒体基因组进化不可或缺的驱动力，然而这些重复序列的起源仍然未能知晓。

定边金藻中线粒体基因重排现象

到目前为止，已测9个完整的环状的定边金藻纲的线粒体基因组，作者对它们进行了比对，它们分别属于4个目：Isochrysidales，Pavlovales，Phaeocystales 和 Prymnesiales。基因组大小为24,009~43,585bp，基因组大小的不同主要与重复序列有关。比较定边金藻门37个已有线粒体基因组的基因组成，除了8个新基因外，共发现24个已知功能的蛋白质编码基因(补充表S9)。并对基因组中出现的特异基因进行了描述。

在rRNAs方面，除Pavlovales线粒体基因组含有5S rRNA外，大多数线粒体基因组，仅含有两个rRNA基因(16S和23S)。tRNAs的数量从24个到28个不等，tRNA基因组成也有一些细微的变化(表2)。

不同物种基因排布在双链上的方向也有所不同。对定边金藻门的11个物种的线粒体基因组（包含两个未完全组装的线粒体基因组）进行共线性分析，发现了许多基因重排的现象。

两个 E. huxleyi 线粒体基因组在整个长度上拥有近乎完美的共线性基因排列。除了1个独特的新基因 orf104 。相比之下，I. galbana 与其他两个 E. huxleyi 线粒体基因组共享 11 个局部线性区（图 2B），可以将其分配到蛋白质编码基因的三个大型保守线性基因簇中（图 2C，D）。作者对三者间可能发生的基因易位、倒位和重复区插入的现象进行了推测。

Sarah：竟然有这么多细致的小点可以分析探讨，有没有拿小本本记下来呢。

反式剪接基因

cox1编码细胞色素 c 氧化酶的 cox1 基因是I. galbana线粒体基因组中唯一发现的中断基因。它被分成两个外显子，中间有 12 个基因（图 2D）。Illumina RNA-seq 数据比对结果证实了球藻中存在两个远距离分散的 cox1 外显子（图 1、3）。 cox1 的四个外显子边界也可以通过 RNA-seq 数据精确确定（图 3C）。从 Illumina 和 PacBio 平台生成的 DNA-seq 数据的比对也表明在 cox1 的外显子 a 和 b 的边界处没有明显的断点（图3A；补充图 S4），证明了组装结果的可靠性。作者推断 cox1 的内含子被反式剪接移除。I. galbana 中 cox1不寻常的结构是在定鞭金藻线粒体中观察到的首个反式剪接事件。Group II 内含子被认为对剪接反应至关重要，并且普遍存在于原核生物基因组和源自古细菌的植物细胞器中，对整个线粒体基因组序列的分析确定了与 cox1 的外显子 b 相邻的一个假定的Group II内含子片段（位于位置 18,031–18,074），其编码没有明显的开放阅读框（指定为 Ig_cox1i；图 3D）。在两个 cox1 外显子之间12,111–12,443的位置发现了一个功能未知的新基因 orf110。

小编：DNA测序数据和RNA测序数据互相验证确认组装注释的正确性，你学到了吗？关于反式剪接、大片段重复区、基因重排三者间可能存在的关联性，作者也进行了一番探讨，可详见原文哦。

RNA编辑分析

使用基于参考的单核苷酸多态性 (SNP) 调用策略，与线粒体基因组序列相比，对齐后的线粒体转录组有 6 个 SNP不同，其中两个发生在蛋白质编码区之外，四个发生在 atp6、rps3、nad6 和 rpl16 的外显子区域。进一步严格筛选，基于深度转录组测序的结果，RNA 编辑不会发生在I. galbana的细胞器中，这与前人对绿藻的研究相一致。I. galbana 细胞器中缺乏 RNA 编辑也与 RNA 编辑起源于从祖先藻类谱系分裂出来的胚胎植物的假设一致（Cahoon 等，2017）。

选择压力分析

比较I. galbana 和迄今发现的亲缘关系最近的物种 E. huxleyi 的线粒体基因组， 19 个常见蛋白质编码基因的 Ka/Ks 比值均小于1，且相当低，说明这些基因在等鞭金藻目中受到纯化选择。五个基因（rps3、rps8、rps14、nad2、apt4）表现出最高的 Ka/Ks (> 0.06) 值，但有趣的是，这五个基因中的四个（atp4、rps3、rps8、rps14）没有出现在上述所有定鞭金藻门物种鉴定的核心线粒体基因（15 个基因）中，这表明这四种基因已经发生了快速分化，为植物更好地适应环境。

藻类线粒体基因组中的基因组成

热图比较了九个藻类谱系线粒体基因组中的基因组成。仅包括具有已知功能的蛋白质编码基因。紫色表示该组中存在该基因，而灰色表示不存在；所有组中保守的 17 个基因以红色突出显示。Complex I 基因编码 NADH 脱氢酶的亚基； Complex II基因编码琥珀酸脱氢酶亚基；复合物 III 基因编码细胞色素 bc1 复合物的亚基；复合物 IV 基因编码细胞色素 c 氧化酶亚基；复杂的 V 基因编码 ATP 合酶的亚基。基因cob和cox1、cox2 、cox3存在于所有定边金藻目物种和其他检测的藻类谱系的线粒体基因组中，这四个基因分散在整个基因组中。总体而言，与红藻（45 个基因）相比，绿藻中保留了更全面的 48 个基因，尤其是涉及能量代谢（NADH 脱氢酶亚基）和翻译（核糖体蛋白；图 4）的基因。

系统发育关系探究

根据I. galbana 线粒体基因组和从GenBank中获得的共204个(8个藻类谱系、10个门)中非冗余的COX1氨基酸序列，构建了最大似然(ML)系统发育树(图5；补充表S14)。同时，多基因即183个线粒体基因组的10个常见的单拷贝蛋白编码基因也被用来构建ML树(补充图S7、S8)。结果表明，所有的谱系都表现出良好的内部联系。单个基因与整个质体/线粒体基因组序列推断的系统发育相似。推测了10个藻门的主要系统发育拓扑结构。基于COX1蛋白对定鞭金藻门18个线粒体基因组的系统发育关系进行推测。

Sarah：终于翻到了总结，小编没有虚晃哦，这篇文章真的很扎实呢~

结论

1. 在本研究中，作者利用Illumina和PacBio测序平台的组合对I. galbana 球等鞭金藻线粒体基因组进行了测序。

2. 该基因组全长39,258bp，共有46个基因，其中蛋白编码基因20个，tRNA基因24个，rRNA基因2个。

3. 一大段重复序列(~12.7kb)分布在线粒体基因组的一个区域，几乎占总大小的三分之一。

4. 首次发现了反式剪接基因cox1，并通过RNA-seq和DNA-seq数据进行了验证。这种大片段的串联重复和顺式剪接到反式剪接的转变可以用高线粒体基因组重排率来解释。

5. 基于深度转录组测序数据的严格SNP调用表明，该物种的两个细胞器都缺乏RNA编辑，这与之前在其他藻类谱系中的研究一致。

6. 为了深入了解定鞭金藻门线粒体基因组的进化，我们对其和8个主要藻类谱系之间的线粒体基因组进行了比较分析。定鞭金藻门线粒体基因组中存在一个由15个能量和代谢基因组成的核心基因集，包括1个cob、3个cox、7个nad、2个ATP和2个核糖体基因。在这个谱系中，基因的组成和排列保守性很差，缺失了许多其他真核生物中的功能基因，包括rps/rpl、sdh、tat、secy基因，这使得它在所有藻类中包含的基因数最小。所有这些都表明，与其他藻类谱系相比，这个谱系的线粒体基因组进化迅速且进化时间较晚。

7. 由204个藻类线粒体基因组的cox1基因构建的系统发育树显示了良好的内部亲缘关系。

这个新组装的线粒体基因组将增加我们对藻类线粒体基因组进化一般趋势的了解，无论是在定鞭金藻门植物内还是在不同谱系的藻之间。

Sarah：还有一点很重要，就是这个物种的培养方法，因为这类物种在测序时常会遇到污染的情况，这会对数据质量造成严重影响，进而阻碍后面的所有研究。

那么，小编怎能不分享给你呢。

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