DNA亲和纯化测序技术(DNA Affinity Purification Sequencing, DAP-seq),通过将编码转录因子的CDS序列构建到含有亲和标签(如Halo-Tag)的载体中进行体外蛋白表达,形成转录因子和亲和标签的融合蛋白;用该蛋白与基因组DNA文库结合,然后洗脱结合的DNA片段上机测序,通过分析即可得到转录因子的全基因组结合位点(transcrption factor binding sites, TFBS),从而帮助我们理解转录因子的功能及调控机制。

应用领域：

• 解析植物生长发育、胁迫响应和品质形成等调控机制
• 疾病机制研究，疾病相关突变对DNA结合能力的影响
• 结合其他组学数据（RNA seq，ATAC seq等），构建基因调控网络

产品优势：

技术路线：

分析内容：

(1)数据评估：数据量统计，数据质量评估统计；

(2)测序数据与参考基因组序列比对；

(3)统计样品Peak区域的位置分布及片段信息(峰检测及计数、平均峰长度、峰长中位数)；

(4)不同样品的Peaks融合，获取所有样品总Peaks；

(5)统计Peak区域相关基因信息、给出基因列表。对基因进行NR, Swissport, Pfam, GO, KEGG, cOG, KOG等数据库注释。并对GO和KEGG进行显著性富集分析；

(6)对Peak区域关联基因进行富集分析；

(7)对Peak所在区域搜寻motif信息。

样品要求：

1. 新鲜组织样本5g，每增加1个转录因子材料增加5g或者基因组DNA 10 μg/转录因子，DNA浓度为200ng/ μL，且无RNA和蛋白污染；

2. 含转录因子CDS序列的质粒(浓度不低于30ng/μL，至少10μL)，提供测序报告；

3. 物种需要有参考基因组。

香蕉MabHLH28通过与MaWRKY49/111协同或独立调控软化相关基因的表达，介导果实成熟

质地软化是水果成熟的生理指标。该研究中，作者基于转录组数据，筛选出一个在果实成熟过程中显著上调表达的MabHLH28基因。DAP-Seq分析显示，MabHLH28与果实软化相关基因启动子区域的‘CAYGTG’核心序列结合，如与细胞壁修饰和淀粉降解相关的基因，并且这些结合情况通过EMSA和DLR实验得到了验证。

DAP-Seq鉴定MabHLH28的结合位点

MabHLH28与成熟相关基因结合的验证

参考文献：

  1. Banana MabHLH28 positively regulates the expression of softening-related genes to mediate fruit ripening independently or via cooperating with aWRKY49/111 (Horticulture Research, 2024, IF = 7.6)

Q1：做这个实验有没有门槛？

没有参考基因组做不了。另外有些转录因子可能体外表达不出来，不过这种情况比较少。此外，一些家族的转录因子需要和其他蛋白形成复合体才能与DNA结合，这些蛋白的风险比较高。

Q2：转录因子上加标签会影响它和DNA的结合吗？

在DAP-seq实验中，目前普遍采用的做法是在转录因子的N端添加标签，因为已有研究表明，对于某些蛋白而言，N端的修饰通常不会显著干扰其三维结构或DNA结合能力。

Q3：实验过程样本怎么设置？

1、样本设置建议：

（1）DAP-seq本身无需处理组，可以直接使用野生型材料作为实验样本。

（2）实验过程中每个样本会分为自身IP样本/Input样本。

IP样本(免疫沉淀样本)：即经过亲和纯化后的样本，用于检测目标蛋白结合的DNA片段。

Input样本(阳性对照样本)：对照样本，帮助识别和过滤非特异性结合信号。早期在DAP-seq开发阶段曾尝试多种对照形式，包括：空磁珠对照；Halo蛋白对照；Input样本对照。实验结果显示，三个对照在检测中均未表现出对DNA的特异性结合能力。

2、样本重复数

为了提高实验数据的稳定性和可重复性，我司自动包含2个技术重复，已满足文章发表需求。

Q4：我能得到哪些结果？

1、实验部分

基因组DNA胶图、片段扩增结果、载体构建菌检胶图和测序结果、蛋白表达质检结果、实验操作图。

2、生信分析

1. 数据评估：数据量、数据质量评估统计；。

2. 测序数据与参考基因组序列比对；

3. Peak区域的位置分布及片段信息；

4. 两个样品的Peaks融合，总Peaks；

5. Peak区域相关基因信息、给出基因列表；

6. 对基因进行多个数据库注释；

7. 对Peak区域关联基因进行富集分析；

8. 对Peak所在区域motif注释。