SQANTI:广泛分析全长转录组测序数据，用于全长转录组鉴定和定量中的质控

  摘要  

  使用三代测序进行全长转录组高通量测序为发现数千种新的转录本铺平了道路，甚至在注释良好的哺乳动物物种中也是如此。测序技术已经发展成为研究的必需品及能够发现变异体的工具。本研究介绍了SQANTI，一种用于三代转录组测序分类的自动化方法，它可以使用47个唯一的描述符来评估数据和预处理方法的质量。以小鼠神经转录组（(PacBio三代测序）为例来说明SQANTI是如何有效地分析全长转录组的组成。通过RT-PCR对 ToFU处理过的PacBio的转录本进行整体评估，发现许多新的转录本是测序方法的技术伪影，SQANTI质量描述符可以用来设计过滤策略删除它们。在这些精确的转录本中，大多数新的转录本都是现有剪接位点的新组合，既丰富了一般代谢功能，也丰富了神经特异性功能。本研究揭示了：这些新的转录本对正确量化转录水平（通过最先进的基于二代的量化算法）有着重要的影响。通过将SQANTI处理过的转录本和公共蛋白质组学数据库进行比较，发现在蛋白质组学检测中，很难进行可替代的异构体检测。SQANTI允许用户最大限度地利用三代测序的分析结果，通过提供质量评估来精确转录本质量。

  SQANTI介绍    

  SQANTI是用Python实现的，用R进行统计分析和生成描述性绘图。其程序有两个主要功能：sqanti_qc.py 和sqanti_filter。  

  sqanti_qc.py:(1)根据所提供的参考序列校正转录本，并返回校正后的转录本。(2)将测序的转录本与现有的基因组注释进行比较，生成基因模型，并根据剪接点对转录本进行分类。(3)利用GeneMarkS-T对ORFs进行了预测。(4)运行了预测RT切换的算法；(5)返回转录本水平和剪接水平描述性文件（总共有47个描述符）。  

  sqanti_filter：使用SQANTI特性输出通过两种不同的方法对工件执行筛选。内启动过滤器选项删除在基因组3‘端位置下游腺嘌呤延伸的转录本。机器学习过滤器基于上述策略的用户数据进行Random Forest 分类。  

  图1 实验模型和SQANTI分析综述

  实验及分析结果说明  

  1.材料与方法  

  实验材料：新生小鼠（4d）神经祖细胞(NPCs)、少突胶质祖细胞(OPCs)  

  测序平台：Illumina、PacBio  

  实验流程：见图1C

  2.从转录本长度和剪接点对转录本进行评估 

  三代转录组测序的一个基本目标是捕捉转录组复杂性的程度，并获得完整的转录本。SQANTI包括所有描述的基本图形，以便于研究这些方面。由于分析提供了转录本分类细节，增加了对测序结果质控的理解度。作者从SQANTI分类中各组分转录本长度对转录本情况进行了描述（图2），表明：三代测序的小鼠神经转录组，恢复了全长转录本； 同时，由于剪接事件和3'/5'端长度的变异，相对于小鼠参考转录组，具有重要的新颖性。

  图2. 校正的PacBio转录本的SQANTI特征

  从可变剪切角度对校正后的转录本进行评估。作者对剪接点的类型进行分类并对其在在个各分类中做了评估，发现：新的非标准剪接分布比较集中，说明实验伪影可能存在（图3A）；5'端无论是标准的还是非标准的，都是不能被观察到 (图3B)，这可能是5‘端未加注释的结果，且5'端前120nt的新可变剪接转录本几乎没有short reads支持(图3B)；另外作者还预测了reverse transcriptase (RT) template switching，这个机制能解释一部分新的非标准剪接。

  图3. 校正的PacBio转录体中的剪接连接特征

  3.PacBio转录本的PCR验证

  为了揭示 ToFU分析所检测到的转录本是否正确，我们对67个包含不同SQANTI类别的mRNAs进行用dT引物了RT-PCR扩增，30个用随机引物进行了扩增验证（下表1）。结果表明：在NNC（新的未注释转录本）中出现的伪转录本较多。图4A是对下表的举例说明。

  4利用SQANTI特性构建ToFU质量控制过滤器

  作者基于这些特征训练机器学习(ML)分类器对 ToFU输出的转录本进行了过滤。将SQANTI预测结果与RT-PCR验证结果比较，发现两者相差不大（图4B）。并将SQANTI与其他过滤方法进行了对比，结果显示SQANTI的结果得分最高（图4C、D）。作者将SQANTI过滤前后的分类描述状况进行了比较（图4E）。

  图4.SQANTI在鼠标数据集上的过滤性能

  5.与蛋白数据库比较分析

  作者对SQANTI发现的新转录本进行了GO富集分析，发现这些转录本在代谢过程、神经发生调节、少突胶质细胞谱系、行为和钾离子运输调控等方面富集（图5A）。此外还研究了公共蛋白质组数据库中的肽数据是否可以支持SQANTI发现的新转录本（图5B、C）。结果表明，在公共蛋白质组数据库中直接检测新的和替代的转录本的编码肽链是不可行的。其具体过程感兴趣的读者可查看原文。

  6.SQANTI对二代测序准确量化转录本有重要影响

  最后，作者用二代测序结果map三代转录本和参考基因组的转录本上，发现可变剪切出现的转录本结构差异会导致预测到的该基因的表达最多转录本出现误差。详情因篇幅原因这里不再讲述，还请读者到原文查找。  

  注：该软件的使用前提为有参物种，且物种参考基因组的组装质量对该软件处理结果有很大影响。

  研究亮点  

  1.在质控方面，该软件分类详细，质控角度相对全面，且有具体的描述符，便于用户精确转录本质量。  

  2.在过滤伪转录本方面，该软件准确率较高，且作者有进行RT-PCR的验证。  

  3.在本文章中，作者对该软件的评估比较全面。