环境胁迫下转录和翻译关系的研究：RNAseq和iTRAQ分析微型裸腹蚤有性繁殖和孤雌生殖

  摘要 

  微型裸腹蚤(Moina Micrura)是幼鱼的理想饵料和经济上重要的甲壳类动物，在水生生态系统可以作为评价水质的指标。与水蚤(Daphnia)相似，为了适应外部环境它的繁殖模式可以从孤雌生殖(PF)转变为有性生殖(SF)。为了揭示微型裸腹蚤的生殖转换机制，我们利用RNA-Seq和iTRAQ分析方法，研究了SF和PF在微型裸腹蚤中的差异表达基因(DEGs)及其蛋白产物。在SF中共检测到1665个DEGs(702个上调，963个下调)和600个差异表达蛋白(DEPs)(102个上调，498个下调)。相关分析表明，31个基因在转录和蛋白质组水平上均有显着差异，包括15个上调基因和16个下调基因。同时，   528个DEPs在转录水平上有不一致的表达，这意味着转录后(包括翻译)调节。这些高度上调的基因及其蛋白产物主要属于与珠蛋白（globin-related）有关的家族、卵黄蛋白相关（ vitellogenin-related）家族、角质层（cuticle-related）相关家族、热休克（hsp）相关家族和甲基转移酶相关家族，它们都参与了水蚤的生殖转换。相反，PF中上调的基因及其蛋白产物与代谢过程密切相关，这可能是造成微型裸腹蚤种群快速繁殖的原因之一。

  材料与方法  

  材料：微型裸腹蚤（中国，武汉南湖）  

  方法：在25°C条件下，在12 h光/12 h黑暗光周期中培养健康的孤雌个体，根据微型裸腹蚤的生物学特性喂养小球藻1年。当种群密度达到一定水平时，就会发生生殖转换。采集健康SF和PF，并确认其生殖状态。  

  转录组测序平台：Illumina HiSeqTM 2000  

  蛋白分析平台：LC/LC–MS/MS、 iTRAQ

  研究结果

  1.转录组的鉴定与分析

图2 SF和PF中DEGs和DEPs的火山图

  FPKM分析表明，SF和PF中有 1665个DEGs (FC>2.0和FDR<0.001)。与PF相比，963 SF中基因上调，702个基因下调(图2A)。  

  图3 对SF和PF中DEGS和DEPS的GO富集分析

  GO富集分析表明，SF中的上调基因与角质层、血红蛋白、氧化应激、Vg高度相关。另外，SF中的大多数下调基因都是在代谢过程中被分类的(如大分子/杂环/氨基聚糖代谢过程)、初级代谢过程(如蛋白质代谢过程、蛋白质水解与碳水化合物/多糖代谢过程)，催化活性(如水解酶活性和转移酶活性)，肽酶活性(如内肽酶活性和丝氨酸-类型酶)(图3A)。

  图4 对SF和PF中DEGs和DEPs的KEGG通路富集分析

  KEGG通路富集分析表明，SF中大多数上调基因与机体系统、代谢广泛相关，此外，生物系统(如蛋白质的消化和吸收、溶酶体等)和环境信息处理被发现是下调基因中最富集的通路（图4A）。

  2.蛋白组的鉴定与分析

  图5：PF和SF蛋白质组的鉴定和分析

  蛋白质组的iTRAQ分析显示，有2352个蛋白质被检测到。数据库中的肽段匹配误差在0.05Da以下(图5A)。大多数蛋白质的分子量如图5B所示。如图5C所示，肽长在9-20 aa之间，其中9-15 aa为峰区。图5D中显示了匹配到蛋白质的肽的数目，表明蛋白质序列的覆盖度是在1-40%。

  SF与PF(FC≥1.5，p值<0.0 5)之间共鉴定出600个DEPs，其中SF中有102个上调蛋白和498种下调蛋白(图2B)。GO富集分析表明， DEPs主要为细胞成分(如细胞组成、大分子复合体、细胞器等)、结合、细胞过程和代谢过程(图3B)。 KEGG通路富集分析表明，SF中的上调蛋白主要参与遗传信息处理，特别是与真核生物中RNA转运、核糖体和核糖体生物发生有关的翻译过程，而只有核糖体才是SF中下调基因中最富集的途径（图4B）。

  为了进一步了解生殖转换的机制，对DEGs和DEPs进行了进一步的筛选，并在SF，PF中鉴定了120个上调基因和103个下调基因(FC≥100)，也鉴定了50个上调蛋白(FC≥1.5)和130个下调蛋白(FC≥1.6)。这些在SF上调的DEGs和DEPs中，我们进一步确定了一些可能与生殖有关的关键基因和蛋白(表1，2)。

  3.SF和PF中转录组与蛋白质组的关联分析

  图6 蛋白质组和转录数据的比较分析

  如图6A所示，在蛋白质和转录水平上共鉴定出2352个基因，然而，在DEGs中也只检测到72种DEPs(图6B)。相关性分析（P＜0.01，图6C）表明转录水平基因的相对表达量与蛋白水平呈正相关，但相关度较低。GO分析表明，DEGs和DEPs主要富集在“结合”、“代谢过程”、“催化活性”、“细胞过程”和“单一有机体过程”(图6D)。此外，在最显着富集的通路中，大多数DEGs聚集在“代谢途径”、“核糖体”和“蛋白质消化和吸收”中，而DEPs主要的富集通路则是“核糖体”、“核糖体生物发生”、“RNA转运”和“剪接体”(图6E)。我们在蛋白质组水平上发现59个上调和469个下调蛋白，但其转录水平mRNA表达并没有变化。此外，4种上调蛋白和11种下调蛋白在转录本水平上呈现相反的丰度变化(图6F)。

  转录和蛋白质组学数据的关联分析，我们在转录本和蛋白质水平上检测到SF中15个上调（表3）和16个下调基因（表4）(有功能注释)。

  为了好地突出转录后过程的重要性，我们进一步在SF中确定了13个关键的生殖转换相关的DEPS（表5）。另外，为了进一步证实转录和蛋白质组学结果，随机选择了21个DEGs或DEPs进行qRT-PCR验证。结果表明，SF中有11个上调基因被qRT-PCR证实，此外，PF中的上调基因也被RT-PCR证实（表6）。

  结论  

  在本研究中，基于转录和蛋白质组学分析微型裸腹蚤的DEGs和DEPs(SFvs.PF)，并鉴定与生殖转换有关的关键基因。GO和KEGG分析表明，微型裸蚤(SFvs.PF)中上调和下调的基因具有不同的富集通路。转录组学和蛋白质组学的关联分析表明，差异蛋白在GO的富集与转录组学结果一致。然而，在KEGG通路富集中，差异蛋白质在遗传信息处理中富集，而在转录组水平上，各种代谢过程占主导地位。此外，本研究表明：31个基因在转录和蛋白质组水平上都有显着差异，包括16个上调基因和15个下调基因。虽然转录和翻译调控通常是相互协调的，但本研究也发现了许多相反的趋势，暗示转录后调控的参与。为了进一步探讨转录后调控在生殖转换中的作用，作者还挖掘了一些蛋白质，这些蛋白质在mRNA和蛋白质水平趋势相反。说明这些转录后调控的基因在微型裸腹蚤生殖转换中的作用可能比转录调控基因更为重要。