甘薯二倍体野生近缘种盐胁迫转录组分析

  摘要  

  Ipomoea imperati是甘薯的野生二倍体近缘亲属，具有高盐度耐受能力，有巨大的作物改良潜力。我们比较了盐胁迫下的I. imperati转录组与对照，以确定候选基因和盐响应中涉及的途径。De novo组装产生67,911个转录本，且覆盖度较高。共有39,902个推定的基因被注释到，936和220个基因分别参与根和叶中的盐反应。功能分析表明在I. imperati在整个的盐胁迫期间系统响应，其中包括四个代谢过程：感觉起始，转录重编程，细胞蛋白质组分变化和细胞稳态调节。我们鉴定了许多参与ABA信号传导途径的候选基因，以及转录因子，转运蛋白，抗氧化酶和与合成、催化代谢相关的酶。此外，两种膜转运蛋白基因，包括液泡阳离子/质子交换蛋白和肌醇转运蛋白，被认为在耐盐性中起重要作用。该研究在生态适应上提供基础，也为将来在甘薯和其他作物改良中的应用提供有价值的信息。

  材料与方法  

  前期处理：所有种子在发芽前都被划伤。  

  生长条件：长日照条件下16小时光照/ 8小时黑暗。湿度：50％。 

  两周龄幼苗用100mM-500mM的NaCl溶液浇水5天以适应盐土壤。  

  处理组：在第6天，每天施用600mM NaCl，持续7天。  

  对照组：用淡水浇灌的幼苗。  

  在处理后0小时，3小时，24小时，3天和7天分别收获来自处理的（600mM NaCl）和对照（淡水）植物的根和叶的三个生物学重复。所有样品快速放在液氮中冷冻并储存在-80℃下用于RNA提取。

  结果

  1.   I. imperati对盐胁迫的表型和生理反应。

  图1. 在0小时，24小时，72小时（3d）和168小时（7d）比较  

  I. imperati的对照（淡水）和盐处理的（600mM NaCl）植物。

  在用100mM-500mM的连续NaCl预处理5天后，每天用600mM NaCl施用预处理的植物，刚开始几乎未见外观上的差异。过后，处理过的植物相较于对照植物，生长相对迟缓。但是在高盐度条件下（600 mM）没有观察到严重的损害，例如叶枯萎或脱水，表明I. imperati具有高耐盐能力。（仅仅是延迟发育但并未严重受损）。

  图2.  I. imperati的对照和盐处理中根和叶组织的离子含量。（A）对照和盐处理根和叶中的Na+含量。（B）对照和盐处理根和叶中的K+含量。（C）对照和盐处理根和叶中的K+ / Na+比。 R-C =对照根; R-T =盐处理根; L-C =对照叶; L-T =盐处理叶。

  盐胁迫期间，Na +在叶和根中均显着增加且在168小时观察到呈4倍增加。K+在根中含量没有显着变化，但在168小时后略有下降。叶片中的K+含量在四个时间点以相等的量减少。在盐处理期间，K+的含量没有太大变化，表明在高盐度条件下，K+的摄取和转运没有显着影响I. imperati。根和叶之间的K+ / Na+比率盐处理与对照相比显着降低，但是K+ / Na+比率在0小时，3小时和24小时没有显着变化，表明在早期盐胁迫期间可能存在快速响应的离子调节机制以维持K+和Na+稳态。

  2.  盐胁迫下不同表达基因的鉴定

  图3. I. imperati盐处理根和叶组织的转录组火山图

  FDR值≤0.05和| Log 2 fold change（FC）| ≥1用于鉴定差异表达的基因（DEG）。（a）I. imperati叶; （b）I. imperati根。红点表示表达差异显着， FDR<0.05，蓝点表示无差异，FDR> 0.05。

  在盐处理下，根中发现936 DEGs，在叶中发现220个，两种组织均差异表达的基因有36个。根中的DEG比叶中的更多，这意味着在盐处理下根可能会经历更复杂的转录调控。在根中，上调的DEG的数量大于下调的DEGs（544上调和392下调）。在叶片中，下调DEGs大于上调（75个上调，145个下调）。Blast2Go分别对根和叶中的500个（53.4％）和129个（58.6％）DEG进行了注释。虽然差异基因数量不同，但GO类别分类是相似的，例如“代谢过程”，“生物调节”和“对刺激的反应”等。

  3.  差异表达基因的GO富集分析

  图4. 差异表达基因GO富集分析

  GO富集分析揭示了植物对非生物刺激，外部刺激，化学刺激，有机物质，防御反应以及叶子和根中激素刺激的反应。在根中，有18个途径被注释，包括10个生物过程，6个细胞组分和2个分子功能。在叶中，有14个途径被注释，包括9个生物学过程，4个细胞组分和一个分子功能。代谢过程，生物调节，催化活性和抗氧化活性均在根中激活，但在叶中不激活。

  表1.  KEGG注释到的91种不同的途径，其中前10位描述于此。

  显示了根中最显着诱导的途径，确定了哪些途径是最活跃的。根据功能注释显示，DEGs参与了离子稳态、清除活性氧、激素代谢、信号转导、氨基代谢、碳水化合物代谢和转录因子调控等多种生物学过程。

  4.  qRT-PCR验证RNA-Seq基因表达分析

  图5. 通过qRT-PCR验证RNA-Seq和基因表达分析。横纵坐标分别代表了15个随机选择基因在转录组和定量pcr得到的表达倍数的变化，反映了表达结果的相关性。r2越趋近于1，则相关性越高。

  图6. 采用定量qRT-PCR方法对I. imperati根(绿线)和叶(蓝线)的表达谱进行验证。x轴表示五个时间点，y轴表示由三个生物学重复获得的相对表达平均倍数的变化。

  在大多数情况下，表达变化在根中比在叶中更显着。对于根，选择的DEG在盐胁迫后3小时和/24小时显着上调，这意味着在盐胁迫后根中的表达模式迅速改变。在8种转运蛋白转录物中，来自CAX和INT基因的转录物（图6N，T）显示出根系的显着变化。高盐度导致基因表达显着增加。在24小时时，CAX和INT的表达分别增加了22倍和53倍。发现与ABA信号传导途径和ABA生物合成相关的转录物在根和/或叶中上调（图6A-F）。转录因子bHLH和ILR3均在叶和根中都显示出上调，3小时时bHLH的表达最高，72小时时ILR3的表达最高（K，L）。

  图7. 在I.imperati中响应盐胁迫激活的整个响应系统的示意图。

  首先通过ABA信号传导途径或RLK感知盐胁迫，然后激活的信号传导途径调节转录水平重编程，导致基因表达和细胞蛋白质组分改变。

  总结  

  1.盐胁迫下，广泛的遗传调控是造成I. imperati耐盐性的主要原因，在盐胁迫期间通过四个过程系统响应，主要包括：感觉系统启动，转录重编程，细胞蛋白质组分变化和细胞稳态调节。  

  2. 由于甘薯的基因组较大，六倍体，雄性不育和自交不亲和性这些特点，针对性状改善的常规育种受到限制。文章利用了一个与甘薯密切相关的二倍体野生近缘种I.imperati，它提供了独特的耐盐能力，可作为研究盐适应和提高甘薯耐盐性的遗传资源。本研究中的转录组分析不仅提供了大量的生物信息学数据，而且拓宽了适应海滩沙丘等盐胁迫下的遗传基础。

  原文链接：https://www.nature.com/articles/s41598-017-09241-x