RNA-Seq和sRNA-Seq联合分析，揭示了芜菁皱缩病毒感染后的拟南芥复杂的抗病毒防御网络

  摘要：

  为了识别特定的与miRNA调控途径相关的植物抗病毒基因，对拟南芥野生型和dcl1-9突变体进行 RNA测序和sRNA测序。在TCV感染的野生型拟南芥中，共有5204个差异表达基因。然而，在受感染的dcl1-9突变体拟南芥中，只有595个差异基因。对共有DEGs和dcl1-9独有DEGs的GO富集分析显示大多生物过程都被受感染的野生型植株影响。此外，miRNAs在普通和受感染的野生型拟南芥之间的表达模式也有差异。研究结果表明PPR基因可能在植物抗病毒防御中发挥重要作用。

  材料与方法：

  材料：拟南芥Col-0野生型（WT）和dcl1-9杂合（突变体）的植物在光照18 h、黑暗6h，22℃的生长室中培育。

  取材方法：5微克纯化的TCV粒子悬浮在磷酸盐溶液中，接种到4周龄的拟南芥上。对照组也接种了等量的磷酸盐溶液。为了尽量减少实验误差，所有的叶片样本都在接种三次的六叶龄阶段收集。所有实验重复三次。

  测序策略和分析流程：

  测序：Illumina Hiseq2000；PE 150bp、SE 50bp。

  分析：比对：Tophat、Bowtie；

  差异基因：DESeq；

  已知miRNA的分析：miRDP；

  结果：

  1、WT和dcl1-9突变体之间的TCV复制水平。

  A、WT和dcl1-9突变体植株在感染TCV 7天后的症状。

  B、用Western blot估计病毒复制水平。蛋白条带的强度用ImageJ软件量化，野生型和突变型之间没有显著不同。Rubisco被选为加载控制。

  2、转录组数据

  四个文库共得到超过1.8G的clean reads。其中，野生拟南芥的86.6%和85.73%，dcl1-9突变株的78.33%和80.17%比对到参考基因组。在感染的突变体中，病毒比对率较低（1.73%）；在感染的野生型中，病毒比对率达到7.19%。

  DEGs的分布情况。

  A、火山图，红色为差异基因。（左侧野生型，右侧突变体）。

  B、前20个DEGs的热图。

  C、D、野生型和突变体中前20个DEGs的相对表达水平。

  E、野生型和突变体中上调和下调DEGs的数量。

  F、野生型和突变体中共有的和独有的DEGs的维恩图。突变体中DEGs少。

  3、GO富集分析

  A、B、野生型和突变体中共有差异基因和突变体中特有差异基因的GO分类类别。

  C、D、GO分类类别的TreeMap可视化。最相关的过程是细胞代谢、细胞蛋白变性、信号转导。突变体中特有差异基因最相关的过程是应激反应。

  E、突变体中特有的前10个上调、下调DEGs的相对表达水平。

  4、small RNSAs的数据处理

  A、B、差异表达miRNAs的分布的火山图和热图。

  C、sRNAs的长度分布。

  D、vsiRNAs（小病毒干扰RNAs）的长度分布。野生型和突变型模式不同。

  E、差异表达miRNAs的相对表达量。

  5、响应TCV感染的差异表达miRNAs（共有30个） 

  6、本研究中新发现的miRNAs

  共预测得到94个新的miRNAs，其中序列长度大于10bp的列举如下。

  亮点分析：

  1、比较miRNA及其靶基因的表达模式，联合sRNA-seq和RNA-Seq数据进行分析。正如预期的那样，大多数靶基因的表达趋势与相应的miRNA相反。

  2、dcl1-9突变体中，DEGs数量大幅降低，突出dcl1-9对抗TCV反应起负作用。此外，PPR基因可能在植物抗病毒防御中发挥重要作用。

  参考文献：

  Analyses of RNA-Seq and sRNASeq data reveal a complex network of anti-viral defense in TCV-infected Arabidopsis thaliana.

  SCIENTIFIC REPORT. 2016, IF= 5.228