真菌诱导玉米蛋白乙酰化鉴定
发布日期：2019-03-18 浏览次数：2118
摘要
赖氨酸乙酰化是一系列生物过程中多种蛋白的一种重要翻译后修饰。组蛋白乙酰化在植物防御机制中的作用已经有了很好的研究基础，病原菌效应蛋白编码的乙酰转移酶能够直接使宿主蛋白发生乙酰化进而改变免疫力。但是针对植物内源酶是否能够调节免疫反应中的蛋白乙酰化并不清楚。本文探究了炭色孢腔菌产生的一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂（HCT）如何通过改变蛋白乙酰化来提高毒力。利用质谱分析技术对3636种蛋白进行了定量，并对HCT处理/HCT不足或能产生HCT的炭色孢腔菌处理的玉米的2791个位点的乙酰化水平进行鉴定。分析结果表明乙酰化是一种广泛存在的翻译后修饰，并且影响玉米蛋白的编码。此外，外源HCT的使用结果表明植物编码的蛋白（组蛋白去乙酰化酶）能够调控免疫反应过程中非组蛋白的乙酰化。
材料方法
玉米近等基因系：B73-NIL（hm1A），mock HCT solution (0.1% Tween-20), 100 μM HCT (Sigma), HCT-deficient (Tox-) or HCT-producing (Tox+) strain of C. carbonum。每种处理：多个植株的叶片混合，4个生物学重复。
蛋白组检测：非修饰蛋白mock、100 μM HCT、Tox-、Tox+分别用itraq报告基团（114，115，116，117）标记；乙酰化蛋白富集（2mg乙酰化抗体+10mg玉米多肽），检测label-free（mock、100 μM HCT、Tox-、Tox+）；检测平台：Agilent 1200 HPLC system+ LTQ Velos linear ion traptandem；原始数据查找比对：Spectrum Mill v3.03 (Agilent)，B73 RefGen_v2 5b。
MapMan bin enrichment：R（dhyper command），GO富集：VirtualPlant 1.3
研究结果
1、玉米免疫反应蛋白定性、定量
2、HCT诱导的色氨酸生物合成蛋白及Bx植物抗毒素水平
A.三种HCT处理下蛋白的变化韦恩图（上调蛋白171个，下调116个）；B.色氨酸生物合成途径及每个步骤相关蛋白三种HCT处理相对于对照的丰度分析。结果：在HCT、TOX+处理条件下每一步色氨酸合成所需蛋白丰度都上调。
处理44h之后材料中BX（苯并恶唑嗪酮）含量在HCT、TOX+处理条件下都表现出上升，与蛋白组分析预测结果一致。表明C. carbonum（炭色孢腔菌）的侵染能够改变色氨酸的生物合成。
3、真菌侵染改变组蛋白和非组蛋白乙酰化水平
A.质谱分析四种条件下组蛋白H4的乙酰化水平；B.四种条件下乙酰化组蛋白H4 Western blotting验证。HCT、TOX+处理条件下组蛋白H4乙酰化水平显着上升。并发现一些新的乙酰化位点，H4赖氨酸残基5,8,12,16位。除此之外还有H2A.W, H3.1, H3.3及一个类组蛋白的赖氨酸残基特异乙酰化位点。
C/D.HCT处理和对照相比上调的乙酰化肽段62个（155个位点），下调肽段9个（12个位点），高度乙酰化事件主要发生在HCT、TOX+处理条件下。
三种处理条件下乙酰化肽段GO分类分析，HCT、TOX+处理条件下分别有31/8个转录调控相关（转录因子TFIID，转录抑制因子，染色质重塑酶，HAT酶），TOX-处理乙酰化肽段没有和转录调控相关的。和防御相关乙酰化肽段只在TOX+处理条件下检测到，这些结果表明C. carbonum（炭色孢腔菌）利用HCT能改变响应侵染的基因的转录，使得表现出不同的防御应答。另一方面也说明TOX+侵染能够使得乙酰化的防御蛋白功能失活从而抑制宿主的抗性。
所有乙酰化蛋白功能分类（MapMan），总共35 bin，63,542个蛋白；只有“fermentation,” “polyamine metabolism,” “microRNA,natural antisense” 不包含乙酰化蛋白，分别对应59、41和3个蛋白。
主要结论
1、通过对对照和三种HCT处理的玉米进行非修饰蛋白itraq分析，鉴定出响应HCT处理的多种蛋白。并发现色氨酸合同通路中，所有相关的蛋白在HCT和TOX+处理下都是显着上调的，通过验证BX含量证实了C. carbonum（炭色孢腔菌）的侵染能够改变色氨酸的生物合成。
2、针对四种处理条件下组蛋白乙酰化质谱分析发现，HCT和TOX+处理会显着提升组蛋白乙酰化水平，并通过WB实验得到验证。
3、对所有乙酰化蛋白进行MapMan分类发现32/35bin都是存在蛋白乙酰化，表明乙酰化在蛋白组中是广泛分布的。同时通过GO注释HCT、TOX+处理条件下分别有31/8个转录调控相关，TOX-处理乙酰化肽段没有和转录调控相关的，防御相关乙酰化肽段只在TOX+处理条件下检测到；表明C. carbonum（炭色孢腔菌）利用HCT能改变响应侵染的基因的转录，使得表现出不同的防御应答。另一方面也说明TOX+侵染能够使得乙酰化的防御蛋白功能失活从而抑制宿主的抗性。
参考文献
Fungal-induced protein hyperacetylation in maize identified by acetylome profiling[J].2018.PNAS.IF=9.661
