非靶标代谢组学揭示VOCs与番茄对假单胞菌免疫应答的相关性

  植物已经开发了多种防御机制，以保护自己免受生物和非生物胁迫。次生代谢物的积累，显示出许多生物学特性，胁迫反应的主要组成部分。其中，挥发性有机化合物(VOCs)是参与植物对病原体和植食性昆虫的保护，也是吸引授粉者和种子携带者的相关群体。不同的信号分子，如水杨酸(SA)、龙胆酸(GA)、乙烯(ET)或茉莉酸(JA)，在番茄植株上积累了病原菌。SA的积累与无毒性感染有关，而在番茄的兼容互作中发现高水平的GA和ET。JA与植物对植食性昆虫或坏死病原体的反应有关。然而，这些防御分子在感染强毒或无毒的pst菌株的番茄Rio Grande中所起的作用还没有被阐明。  

  本研究应用非靶向GC-MS代谢组学方法分析了用无毒菌株Pst DC3000或强毒菌株Pst DC3000感染的RG-Pto番茄植株中差异的VOCs，并利用用乙酸、丙酸、异丁酸或丁酸和几种羟基单酯(Z)-3-己烯醇对番茄叶片的VOC谱进行了表征。

  材料与方法

  植物材料与细菌接种  

  将植物浸泡在含硅藻土L-77(0.05%)的10mM MgCl2溶液中，以模拟接种。从下至上，在指定的时间采集第3和第4叶，并冷冻在液氮中。第5叶放置在10mL螺旋帽瓶中，保存5h进行ET测定。设置6个生物重复分别用于每个时间段和番茄与细菌互作分析。

  水杨酸和龙胆酸的提取及HPLC分析  

  1525Waters二元高效液相色谱法分离，利用2475Water多λ荧光探测器(λ激发313 nm；λ发射405nm)测定SA和GA。

  茉莉酸和乙烯测定  

  第5叶新鲜组织0.5g用于乙烯测定；利用4890A Hewlett Packard气相色谱分离；每个时间点，设置6个生物学重复，建立ET的标准曲线，并利用MassLynx Waters软件计算ET的含量。  

  在JA定量中，将番茄第3和第4叶中的250mg冷冻组织添加到含有内标二氢茉莉酮酸酯的80%甲醇-1%乙酸中，在4℃下摇动1h。提取液在?20℃保存一夜，然后离心。上清液用真空蒸发器干燥。检测平台：UPLC-Q Exactive

  HS-SPME萃取及气相色谱-质谱分析  

  对于挥发性物质的分析，在10mL顶空螺旋瓶盖中称量100mg冷冻番茄叶粉。加入1mL饱和CaCl2溶液和100mL 750mm EDTA(用NaOH调节到7.5 pH)，轻轻混合5 min。利用顶空固相微萃取(HS-SPME)进行挥发性化合物的提取。在℃时，预保温期和提取时间分别为10 min和20min。用65μmDVB/PDMS纤维进行吸附。色谱分离：Agilent 6890N-Agilent 5975B

  RNA的提取及定量RT-PCR分析  

  材料：番茄叶片；伸长因子1α(eEF1α)作为内参基因

  统计分析  

  方差分析(多因素方差分析)；Metalign软件数据预处理；SIMCA-P 11.0软件用于多元统计分析；Acuity 4.0软件用于层次聚类分析；SPSS 16.0软件用于基因表达与VOCs浓度的Pearson相关性分析。

  主要研究结果  

  1.RG-Pto番茄植株感染无毒株或强毒株时表现出明显的症状差异

  图1 RG-Pto植物的症状变化

  图1显示了感染无毒菌株Pst DC3000或强毒菌株Pst DC3000的番茄植株的症状发展。这些症状出现在0-4范围内：无症状(0)、弱(1)、中度(2)、重度(3)和非常严重(4)。用强毒株接种RG-Pto番茄植株18h后，症状程度为(0)~(1)。这些最初的病变在强度和大小上都有所增加，并在24和36hpi时造成明显的叶损伤，范围分别为(2)~(3)。在48hpi中，坏死病变延伸到总面积，而叶子丧失其牢固性和完全塌陷，这是症状的最大水平(4)。这些症状在番茄植株的叶片中具有强烈的肉眼可见性。相反，在接种无毒菌株Pst DC 3000的RG-Pto番茄植株上，由于Pto 的识别和ETI的建立，在任何时候都没有出现症状(0)。因此，这些免疫的番茄叶片与模拟接种的植物相似。

  2.感染强毒株的RG-Pto番茄植株中水杨酸、龙胆酸和乙烯含量明显升高，而茉莉酸则显着降低

  图2游离和总水杨酸(SA)和龙胆酸(GA)的水平

  图3乙烯和JA的水平

  3.番茄叶挥发性特征在两株假单胞菌侵染后均有不同程度的变化

  图4基于m/z范围内的PLS得分图

  HS-SPME/GC-MS平台对模拟和感染RG-Pto番茄植株共鉴定出73种挥发性化合物：11个酯类(9个脂肪族和2个芳香族)，20个醛类(16种脂肪族，3种芳香族和1种去甲类胡萝卜素)，13种醇(6种脂肪族，1种去甲类胡萝卜素，5种单萜，1种倍半萜)，9种单萜类烃，8种酮(5种脂肪族，1种芳香族，2种类胡萝卜素)，3种倍半萜烃，2种呋喃，2种腈类，4种脂肪酸和1种芳烃。(相似度＞900)

  PLS分析(图4)表明，第一组分(PC1)解释了实验期间(采集时间)中化学成分的变化，而由细菌感染导致的代谢改变明显由第二组分(PC2)表征。图4还显示了两种感染植物中的过度释放代谢物，这些代谢物通过载荷图分析进行鉴定。正如预期的那样，来自未感染植物的VOCs在实验48h内的化学成分相似。然而，受两种细菌感染的植物与模拟植物相比，其代谢谱有明显的变化。这表明VOCs的释放与症状无关。然而，在PLS得分图中未观察到强毒和无毒感染之间明显分离。

  图5受感染植物挥发性化合物的分层聚类 

  图5显示了分层聚类的热图，其包括通过比较感染了无毒或有毒Pst菌株的番茄植物与对照植物（分别为第1列和第2列）的挥发性谱的最有区别的化合物。

  4.番茄叶VOC谱与毒、弱假单胞菌感染株的比较分析揭示ETI的一种特异性挥发性反应

  图6基于m/z范围内的PLS得分图

  为了确定一组特定的挥发性代谢物是否参与ETI等有效防御的建立，通过比较感染了无毒菌株Pst DC3000的番茄植株和强毒菌株Pst DC3000 avrPto/avrPtoB(图6)。层次聚类热图显示了受Pst强毒株感染的番茄植株与无毒感染番茄植株排放的VOCs的差异(图5，第3列)。

  5.细菌感染诱导VOCs生物合成相关基因的特异性表达

  图7不同处理番茄叶片中四种基因的相对表达量

  总结 

  结果表明，GLVs和HMTs在番茄植株反应中起着防御作用。与SA积累不同，SA积累是不相容的相互作用中的典型信号分子，在强毒感染中以较高水平积累，当植物有效抵抗细菌感染时，这些VOCs以较高水平差异释放，这表明它们可以起到防御作用。可以进行进一步的研究，如药理或遗传方法，以检验这种可能性。这些挥发性化合物还可以表现出令人感兴趣的生物特性，如抗氧化剂，抗菌剂，杀虫剂或抗性诱导剂，并且可能是农用化学品和制药工业的良好候选物。此外，过量表达参与这些挥发物生物合成的酶的番茄转基因植物的产生可能导致获得抗性的新的生物技术策略。