暴露于Cu-NPs或CuSO4的点带石斑鱼的转录组学，蛋白组学和生理学分析

  点带石斑鱼是一种原生雌雄同体海水鱼，由于其良好的肉质性质，在中国大受欢迎，具有很高的商业价值。最近，由于纳米技术的快速发展，铜纳米粒子(Cu-NPs)在日用消费品以及电子，医疗，生物科学等行业的应用日益增多。尽管纳米技术产品的广泛应用会带来明显的好处，但是对海洋环境的影响以及与水生生物群可能的相互作用的知识却很少见。铜纳米粒子可以积累在水生生物体中，并转移到更高的营养级别，对动物和人类构成健康危害。

  应用于纳米毒理学的转录组学和蛋白质组学可能有助于了解不同类型Cu污染物在水生生物体中的主要毒性机制和作用模式，并有助于识别纳米粒子暴露和影响的新颖和无偏见的生物标志物。表征转录组和蛋白质组可能提供了深入了解铜诱导鱼肝反应的分子机制，可能是一种有效的方法来识别新蛋白质，以及评估生态风险。

  在本研究中，使用暴露于Cu-NPs或CuSO4 24h的E. coioides幼鱼的肝脏来表征差异表达的基因和蛋白质，并鉴定对Cu-NPs或CuSO4毒性具有特异性的新的分子生物标志物。

  材料与方法

  1.1粒子特性  

  通过电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)确定两个组分中Cu的浓度。每个样品6个重复。  

  通过X射线粉末衍射研究在海水中发生的Cu-NP的组成变化。离心后收集样品，经过夜真空干燥。将干燥的样品立即置于气密的小瓶中，并使用X射线粉末衍射进行分析。

  1.2鱼的饲养和24h LC50计算  

  适应后，将6组鱼(每组10只，平均体重3.1±0.2g)随机放入装有50L过滤海水的容器中，然后暴露于不同浓(0，1.6，2.4，3.7，5.8或9.0mg Cu L-1)Cu-NPs。在接触期间，鱼不喂食，死鱼也被移除。急性暴露期持续24h，在暴露期结束时评估鱼的死亡率。进行三次重复实验，并且使用概率分析统计方法，使用SPASS Statistics 19.0计算LC50值(p≤0.05)。

  1.3点带石斑鱼幼鱼处理及采样  

  基于24h Cu-NPs急性毒性试验结果，测试了三种处理：对照(不处理)和2.4mg Cu L-1作为Cu-NP或CuSO4。每个处理三次重复。24h后从每个重复中随机取出鱼，安乐死后在冰盘上解剖。用肝素化注射器从尾静脉抽取血液进行生化分析。取出肝脏，用生理盐水溶液冲洗脂肪，肝脏在液氮中速冻供后续试验使用。为了进行组织学观察，从每个重复样品的剩余鱼取得肝脏样品(左叶)。

  1.4脂肪含量和脂肪酸组成分析  

  提取E.colioides幼鱼肝脏的脂质，然后通过GC/MS分析样品的脂肪酸组成。为了进行组织化学观察，在低温恒温器切片机上切下冷冻的肝脏(左叶)，在4％(v/v)甲醛中固定10min，用油红O染色，用于光学显微镜观察。

  1.5转录组学分析

  测序平台：Illumina Hiseq2500(Illumina, San Diego, CA,USA)  

  对照组：SRX2403593；CuSO4处理组：SRX2403592；Cu-NP处理组：SRX2403594。

  1.6蛋白质组学分析  

  用于iTRAQ分析的肝脏样品与RNA-Seq相同。

  1.7实时荧光定量验证转录组  

  为了验证转录组数据，选取4个基因(3个上调，1个下调)用于实时PCR。

  结果与分析

  2.1Cu-NPs的特性  

  表1本研究中使用的Cu-NPs的特征  

  图S1.Cu-NPs和CuSO4在海水中24h后的溶解

  2.2组织学观察

  图1.(A)24h后Cu-NPs和CuSO4对幼鱼的毒性和(B)暴露于Cu-NPs或CuSO4 24h后E.colioides幼鱼的肝脏形态

  2.3血液学和血浆分析

  表S1.暴露于Cu-NPs或CuSO4 24h对血液和血浆性质的影响  

  2.4维恩图分析

  图2.在CuSO4或Cu-NPs暴露24h后E.colioides幼鱼肝脏中显着差异的基因和蛋白质

  2.5转录本和蛋白质的GO功能分类

  图3.E.colioides转录物和蛋白质的基因本体(GO)功能分类

  2.6COG功能分类

  图4.E.colioides转录物和蛋白质的直系同源基团(COG)功能分类簇

  2.7KEGG通路分析

  图S3. E.colioides转录物(上)和蛋白质(下)的KEGG通路分析

  2.8RNA和蛋白质表达的相关性分析

  表2.在Cu-NP和CuSO4处理中相同表达趋势的转录物和蛋白质列表  

  2.9通过mRNA表达验证转录组数据

  图S4.通过四种差异表达基因的实时定量PCR验证转录组数据

  2.10肝脏脂质含量与脂肪酸组成

  图5. Cu-NPs或CuSO4暴露24h，E. coioides幼鱼肝脏中的脂质含量和脂肪酸组成

  总结  

  在大多数研究中，蛋白质组分析是基于转录本，假设转录组预测的蛋白质几乎可以覆盖定量蛋白质组学发现的所有蛋白质。然而，基因调控涉及复杂的过程，导致转录组分析中的缺陷以及不准确性。因此，仅基于转录组结果来定义蛋白是不够的。在本研究中通过Illumina-seq和iTRAQ使用NCBInr(NR)，基因本体论(GO)，基因和基因组的京都百科全书（KEGG），直系同源基因簇(COG)，Swissport和Uniprot数据库鉴定了基因和蛋白质，专注于在转录水平和翻译水平上一致的上调或下调的蛋白质。  

  使用暴露于Cu-NPs或CuSO4 24h的E. coioides幼鱼的肝脏来表征差异表达的基因和蛋白质，并鉴定对Cu-NPs或CuSO4毒性具有特异性的新的分子生物标志物。当进行转录组和蛋白质组结果的相关分析时，21个基因/蛋白质显示调节的一致性变化，最显着的是与脂质代谢有关的基因/蛋白质。结果提供了关于急性Cu-NPs或CuSO4暴露的点带石斑鱼响应的重要新信息。

  参考文献  

  Integrated transcriptome, proteome and physiology analysis of Epinephelus coioides after exposure to copper nanoparticles or copper sulfate. Nanotoxicology, IF=6.428.