黄萎病菌全基因组测序（三代+光学图谱）
发布日期：2019-03-18 浏览次数：2473
摘要
生物全基因组序列的研究是生物学研究的一个重要的方面。下一代测序技术的出现，尤其对那些没有模式生物的研究带来了基因组学研究的希望。下一代测序技术（Next-generation sequencing，NGS）大大提高了基因组测序的速度、覆盖度以及测序读长。然而，真核生物基因的测序会产生很多分散的测序元件。而且很多与基因组结构和进化相关的遗传信息都隐藏在那些未完成组装的区域内。本研究针对黄萎病菌评估了各个国家的最先进的测序和组装策略，目的是为了组装出一个连续的、完整的基因组。比较包括PacBio公司下一代测序技术（长reads构建的超大contig）与Illumina公司组装的黄萎病菌基因组序列，PacBio获得了足够测序深度，组装质量也更优。甚至能拼接出单个染色体的基因组全长。结合光学图谱的数据，可以获得黄萎病菌8条染色体“端粒——端粒”没有间隙的全基因组组装序列。这样就可以研究之前基因组中未拼接或者拼接质量较低的区域（重复序列:转座子），有利于一种生物的完整性的生物学描述。
研究背景
下一代测序是一种能在短时间内产生千兆数据量的测序技术，与短读长（<500bp）的测序的区别：（1）读长更长（>1k）（2）双端测序主要针对非重复序列区域的组装，对从头测序的基因组组装来说，在重复序列长度超过测序读长时无法组装出高质量序列或发生中断。（3）实时单核苷酸测序（SMRT）和纳米孔测序两种测序策略的最大读长达50kb，因此能够解决重复序列富集区域的测序难题。SMRT测序的平均读长（15~50kb），原核生物完全可以依靠长读长的序列完成全基因组的组装，真核生物则相对较为困难。
在全基因组的序列组装中，光学作图是一项能够构建高分辨率的单核苷酸分子限制性酶切图谱的工具，能够用于基因组组装的电子酶切图谱的构建并单独地将组装的序列重叠群锚定到染色体上。
材料方法
DNA文库：10ug 黄萎病菌基因组DNA，机械打断：22kb，最小7kb。
文库质检：Agilent Bioanalyzer 2100
测序仪器：PacBio SMRT（PacBio RS II）
序列组装：SPAdes (version 3.0.0)：PE+MP（Illumina sequencing500bp~5kb）
长读长组装：HGAP (version 2.0)+ MHAP (version 1.5b1)
基因组质量评估：端粒重复序列：Tandem Repeats Finder (version 4.07b)
重复序列：RepeatMasker (version 4.0.5)
黄萎病菌TE数据库：LTRFinder (version 1.0.5)、RepeatScout (version 1.0.5)
基因组错误组装：Bowtie2（高质量短读长）+FreeBayes (version 0.9.20)（长度长+序列变异识别）
研究结果
1、长测序读长增加基因组组装质量
三代测序+光学图谱=最高组装质量基因组。
2、基因组的从头组装只能依靠长测序读长
与光学图谱比较只有在2号染色体上的一个contig组装发生错误。
3、黄萎病菌JR2菌株基因组的完整组装
黄萎病菌JR2、VdLs17菌株基因组的组装中重复序列的描述。
黄萎病菌JR2、 VdLs17菌株基因组的组装效果的比较。
A. 蓝线代表NheI酶切位点，黑线代表组装序列与光学图谱对应，黑色和绿色框中表示由于重复序列导致的崩溃造成组装序列和光学图谱之间存在差异的位点。
B. A图中1号染色体绿色方框中崩溃的分析（rRNA 基因簇）。
4、黄萎病菌JR2菌株基因组组装质量的评估
5、利用三代测序结合光学图谱对黄萎病菌VdLs17菌株基因组组装
不同测序平台对VdLs17菌株基因组组装的效果表明：三代+光学图谱的组装质量最高。
蓝线代表AluI酶切位点，黑线代表组装序列与光学图谱对应。黑框表示由于重复序列导致的崩溃造成组装序列和光学图谱之间存在差异的位点。
之前对VdLs17菌株基因组组装与三代+光学图谱组装的结果相比，存在大量倒位现象。
利用长测序读长结合光学图谱能够校正之前拼接组装的错误。
6、黄萎病菌菌株基因组完全组装对转座元件描述的优势
结论亮点：
1、利用三代测序+光学图谱拼接得到contig长度远超高二代测序，且质量更高。
2、三代组装结果可以结合光学图谱对拼接结果进行校正。
3、获得黄萎病菌的完成图谱（精确度更高）。4、对基因组中的重复序列（转座元件）描述更准确。
参考文献
Single-Molecule Real-Time Sequencing Combined with Optical Mapping Yields Completely FinishedFungal Genome. MBio. 2015 Aug 18;6(4). pii: e00936-15.IF=6.975
