整合转录组学和代谢组学表征黄芪对干旱胁迫的响应

  黄芪 

  蒙古黄芪是一种在干旱，半干旱地区成功发展起来的中草药。目前，由于野生资源的短缺，了解药草对干旱胁迫的抗性有助于指导种植和优化产量，对生态环境恢复和地方经济发展具有重要作用。本研究结合转录组学和代谢组学分析黄芪对不同干旱水平的特定基因型的响应。

  材料与方法

  1.1植物材料和实验设计  

  选择平均高度为15.0±0.4cm的健康苗，每盆5株幼苗，随机分成两组：一组正常浇水(上午8点每两天浇水)，第二组不浇水模拟干旱胁迫14d。在第0，2，4，6，8，10，12和14天，随机挑选6个盆采集样品：3个根样品迅速在液氮中冷冻清洗，置于-80℃保存；8个根样品用于代谢物分析，置于-20℃保存。另外，叶片样品用于生理指标(RWC(%))测定。

  1.2转录组学分析  

  测序平台：Illumina HiSeq 2000  

  分析软件：Cluster 3.0和JavaTreeview软件

  1.3代谢组学分析  

  检测平台：1H-NMR光谱法配备有反相冷冻探针的600MHz Bruker光谱仪  

  分析软件：Chenomx NMR Suite 7.7软件用于物质的定性和定量

  结果与分析

  2.1干旱驯化过程中的生理变化  

  Fig. 1 Physiological changes of A. mongolicus during progressive drought stress.

  图1 蒙古黄芪对渐进干旱胁迫产生的生理变化

  注：a. 干旱胁迫对土壤含水量(SWC)的影响。b. 干旱胁迫对叶片相对含水量(RWC)的影响。c. 干旱胁迫对根干重的影响(n=8)。  

  根据干旱胁迫下的生理变化，选择了四个关键时点：0d(A)，6d(B)，10d(C)和14d(D)。

  2.2渐进干旱胁迫蒙古黄芪的转录组学分析

  Table 1 Summary statistics of sequencing results.  

  表1 序列统计分析结果  

  使用Illumina Hiseq 2000技术产生了18,885,163,680bp，并检测了88,662个unigenes。这些结果证明测序数据具有足够的数量和质量以确保准确的序列组装和足够的转录组覆盖。

  Fig. 2 Distribution of the homology search of unigenes of against the database.  

  图2 针对数据库的unigenes的同源性搜索的分布

  注：a.Blastx针对蛋白质数据库的多个注释的unigenes的维恩图。b.针对NR数据库的每个unigene的Blastx命中值的E值分布。c.在NR数据库中使用Blastx匹配顶端物种的unigenes的物种分布。

  2.3差异基因的功能分析

  Fig. 3 Transcriptomic analysis of A. mongolicus by high-throughput sequencing.

  图3 通过高通量测序对蒙古黄芪的转录组分析

  注：a.维恩图显示在不同处理点发现的差异表达(DE)基因的数目。b.维恩图，显示仅在不同处理点上调的DE基因的数目。c.维恩图，显示仅在不同处理点下调的DE基因数量(A：对照，B：干旱胁迫6天，C：干旱胁迫10天，D：干旱胁迫14天)。

  Fig. 4 The hierarchical analyses of co-expression transcripts at different stages of drought stress.  

  图4 干旱胁迫下共表达的差异基因的层次聚类分析

  注：绿色表示基因表达下调，红色表示基因表达上调(对照：0天，Water-Stress-1：干旱胁迫6天，Water-Stress-2：水分胁迫10天，Water-Stress-3：干旱胁迫14天)。

  Fig. 5 Plots of gene ontology (GO) terms from the biological process category of genes.  

  图5 基因生物过程类别中的基因本体(GO)条目

  注：a.DE基因总数。b.轻度胁迫下的DE基因(与对照相比)。c.中等胁迫下的DE基因(与对照相比)。d.严重胁迫下的DE基因(与对照相比)。e.轻度胁迫下的主要代谢过程的GO类别(与对照相比)。f.中等胁迫下的主要代谢过程的GO类别(与对照相比)。g.严重胁迫下的主要代谢过程的GO类别(与对照相比)。

  2.4干旱驯化过程中代谢变化的分配

  Fig. 6 An overview of metabolic changes in A. mongolicus, which was exposed to drought stress.  

  图6 干旱胁迫下蒙古黄芪的代谢物变化

  注：a＆b.干旱诱导的代谢物浓度与对照(0天)相比的相对变化。c.干旱期间初级代谢产物谱的差异，热图颜色表示在干旱胁迫的不同阶段各代谢物的丰度(A：对照；B：干旱胁迫6天；C：干旱胁迫10天；D：干旱胁迫14天)。

  Fig. 7 Metabolic analysis using a non-supervised principal component analysis (PCA). 

  图7 使用非监督主成分分析(PCA)的代谢分析

  注：a. PCA得分图；b. PCA载荷图。

  2.5基因表达和代谢物水平的综合分析

  Fig. 8 Pathway analysis related to A. mongolicus under progressive drought stress.  

  图8 渐进干旱胁迫下蒙古黄芪的通路分析

  注：预测的代谢途径是基于文献和基于网络的代谢途径数据库。(A：对照；B：干旱胁迫6天；C：干旱胁迫10天；D：干旱胁迫14天)。黑体表示在这项研究中发现的代谢物。斜体表示没有检测到的代谢物。图中省略了一些代谢物，因为它们不受干旱胁迫的影响。小图标代表基因，大图标代表代谢物。绿色表示下调，红色表示上调。

  Fig. 9 Changes in the expression of genes in starch and sucrose pathways of A. mongolicus under progressive drought stress.  

  图9 渐进干旱胁迫下蒙古黄芪淀粉和蔗糖通路基因表达的变化  

  注：参与淀粉代谢(a)和蔗糖代谢(b)的基因表达。(A：对照，B：干旱胁迫6天，C：干旱胁迫10天，D：干旱胁迫14天）。绿色表示下调的基因表达，而红色表示上调的基因表达。

  总结  

  研究结果表明干旱反应基因的表达表现出强烈的胁迫-剂量依赖性。转录组和代谢组的主要通路的分析揭示了针对不同干旱水平的特定基因型应答。干旱分子策略的变化可能在蒙古黄芪和其他豆科作物如何适应干旱胁迫中起着重要的作用。更重要的是，提供的候选基因可能为翻译方法提供有用的信息，在未来的研究中探索蒙古黄芪或其他豆类作物。

  参考文献  

  Integrating transcriptomics and metabolomics to characterise the response ofAstragalus membranaceus Bge. var. mongolicus (Bge.) to progressive drought stress. BMC Genomics. IF=3.729.